ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 37115—2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 Protocol of diagnosis for infection with abalone herpersvirus 2018-12-28发布 2019-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T37115—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156)归口。 本标准主要起草人：王津津、李清、余卫忠、刘、刘莹、史秀杰、郑晓聪、何俊强、于力、贾鹏、兰文升。 GB/T37115—2018 鲍疱疹病毒病诊断规程 1范围 本标准给出了鲍疱疹病毒病的临床症状，规定了鲍疱疹病毒病组织病理学检测方法、实时荧光聚合 酶链式反应检测方法、聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于鲍疱疹病毒病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AbHV：鲍疱疹病毒（AbaloneHerpesvirus） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylAmmoniumBromide） Ct值：循环阈值（Cyclethreshold) EB：溴化乙锭(EthidiumBromide) EDTA：乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid) PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） qPCR：实时荧光聚合酶链式反应（quantitativereal-timePolymeraseChainReaction） 4. 试剂和材料 4.1 若非注明，本标准所用生化试剂均为分析纯的试剂 4.2若非注明，试验用水应符合GB/T6682一级水的规格。 4.3 Taq酶及10倍Taq酶浓缩缓冲液；Taq酶浓度为5U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。 4.4dNTPs:含dCTP,dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L。 4.5 5qPCR引物和探针： AbHV ORF66F1:5'-CCCGGACACCAGTAAGAAC-3 AbHV ORF66R1:5'-AGGCTGCTATGCGTATGA-3' 扩增ORF66基因长度146bp片段，用于荧光PCR。（参见附录A） AbHV ORF77F1:5'-AACCACTTGTTCGGGTTCT-3° AbHV ORF77R1:5'-AGGGTGATTAATGCGGAGT-3 1 GB/T 37115—2018 扩增ORF77基因长度190bp片段，用于荧光PCR。（参见附录A） 6内对照引物： 4.6 18sF1:5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 18sR1:5'- GCTGGAATTACCGCGGCT-3° 探针(18s rRNA):5'-6VIC-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-TAMRA-3 扩增鲍18srRNA基因长度187bp片段，用于荧光PCR。（参见附录A） 4.7 PCR引物： AbHV-16:5-GGCTCGTTCGGTCGTAGAATG-3 AbHV-17:5'-TCAGCGTGTACAGATCCATGT-C-3 扩增片段大小为522bp~558bp。（参见附录A） 4.8 电泳缓冲液。 4.9琼脂糖。 4.10 组织切片制备和染色试剂（见附录B）。 5 器材和设备 切片机。 5.1 5.2 显微镜。 5.3 荧光PCR检测仪和PCR扩增仪。 5.4组织研磨器。 5.5 5高速台式冷冻离心机。 5.6 超低温冰箱、普通冰箱 5.7 高压灭菌锅。 5.8 干燥箱。 5.9 生物安全柜。 5.10 凝胶成像仪。 5.11 电泳仪。 移液器。 5.12 6 临床症状 参见附录C。 7采样 7.1 采样对象 所有年龄段的易感鲍品种，包括有初期临床症状的鲍、濒死的鲍以及发病区域内的其他健康鲍。 7.2 采样数量 采样数量应符合SC/T7103的要求 2 GB/T 37115—2018 7.3样品采集 按GB/T18088的规定执行，取鲍含神经组织丰富的组织器官，包括脑神经节、侧足神经节等。 8组织病理学检测 8.1取样 取鲍的神经组织。 8.2固定 迅速将组织用Davidson氏固定液（见B.1)固定2h以上。根据组织块大小，固定时间可适当调整， 或放置过夜，期间按需要更换一次固定液。临床样品也可用10%甲醛固定，长期保存。 8.3切片 固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）-→85%乙醇（60min）→95%乙 醇（60min）-→无水乙醇（2次，30min/次）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1)（30min）→二甲苯浸泡 据组织块大小和种类，各步时间作适当调整）。切片厚度不超过6μm。 8.4切片处理染色 二甲苯（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1)（3min）→无水乙醇（3min）→95%乙醇（3min) 85%乙醇（3min）→70%乙醇（3min）→蒸馏水（5min）→苏木精（60min）→伊红（5min）→蒸馏水 (/)()%)%8) （体积比1：1)（5min)→二甲苯浸泡（2次，5min/次）→中性树脂封片。 8.5结果判定 9核酸鉴定 9.1样品处理 样品采取好运送到实验室后，在1.5mL离心管中首先加入25mg～100mg组织，加入150l CTAB溶液（见B.2），用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再加CTAB溶液到900μuL。混匀后置于25℃ 作用2 h待用。 9.2核酸抽提 取前处理好的匀浆组织约20mg放人1.5mL微量离心管中，加800μL抽提液I（酚/三氯甲烷/ 异戊醇）（见B.3），充分混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相：加700uL抽提液Ⅱ（三氯甲烷/ 异戊醇）（见B.4），用力混合30s；12000r/min离心5min，取上层水相：加1.5倍体积一20℃预冷的无 水乙醇，混勾后一20℃过夜以沉淀核酸。15000r/min离心30min，小心弃上清，立即用滤纸吸干（应 尽量充分吸干），37℃干燥20min或抽真空干燥；最后加10μL水溶解后，作为模板待用。 组织核酸提取也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒，按照说明书进行操作。 3.