ICS 65.150 B 51 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T251662010 裙带菜 Wakame 2010-09-26发布 2011-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25166—2010 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本标准主要起草人：王飞久、孙修涛、胡自民、汪文俊、王翔宇、李修良。 1 GB/T25166—2010 裙带菜 1范围 本标准规定了裙带菜[Undariapinnatifida（Harvey）Suringar]主要形态构造特征、生活周期与繁 殖、遗传学特征以及检测方法。 本标准适用于裙带菜的种质检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 NY/T5283一2004无公害食品裙带菜养殖技术规范 3名称与分类 3.1种名 裙带菜[Undariapinnatifida（Harv.)Suringar]。 3.2分类 褐藻门（Phaeophyta）、褐子纲（Phaeosporeae）、海带目（Laminariales）、翅藻科（Alariaceae）、裙带菜 属（Undaria）。 4主要形态构造特征 4.1外部形态特征 4.1.1孢子体形态 藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分。裙带菜孢子体外部形态见图1。 1——固着器； 4——孢子叶； 2——柄； 5——中肋。 3—叶片； 图1裙带菜孢子体的外部形态 GB/T25166—2010 4.1.2固着器 由多次双分枝的圆柱形假根组成，其未端有吸盘。 4.1.3柄 扁平，其腹背隆起而稍圆，柄的边缘有狭窄的龙骨。藻体接近成熟时，在柄的两侧形成耳状孢子叶， 孢子叶定义见NY/T5283—2004中的3.3。 4.1.4叶片 褐色具光泽。幼时长盾形，边缘光滑无缺刻，为单叶。成藻为羽状裂片，叶片的中部是由柄部延伸 而来的中肋，中肋扁平隆起直达叶片的顶端。成藻一般长1.0m～2.5m，宽50cm～100cm。 4.2孢子体内部构造特征 4.2.1表皮 由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成，呈栅栏状。细胞含粒状色素体。 4.2.2皮层 外皮层细胞呈柱状，大小不等，排列不整齐。内皮层细胞大小相近，排列较整齐。 4.2.3髓部 细胞呈丝状或树枝状，排列疏松。 5生活周期与繁殖 5.1生活史 明显的孢子体（2n，大型）与配子体（n，微型）不等世代交替型。 5.2生命周期 裙带菜的生命周期为一年。 5.3繁殖 5.3.1性成熟年龄 8个月～12个月。 5.3.2无性繁殖 孢子体柄部产生孢子叶，孢子叶上产生孢子囊群，孢子囊内形成游孢子。游孢子单细胞，梨形，长 9μm11μm，宽5μm~6μm，有两条侧生不等长鞭毛，长的14.0μm～16.5μm，伸向前端，短的 5.3μm~7.0μm，伸向后端。 5.3.3有性繁殖 卵配方式。雄配子体产生精子囊，每个精子囊产生一个梨形精子，精子（n）长4μm～5um。雌配 子体产生卵囊，每个卵囊产生一个卵（n），卵成熟后排出体外粘着在卵囊口处与精子结合生成合子 (2n). 6遗传学特征 6.1染色体数 孢子体细胞染色体数2n=60。 6.2DNA序列特征 6.2.1ITS-1序列：总长度242bp。 1 71 141 cttttcaacc ccattaaact ctgaatctga actcaaaagg ggggcatgcg cgcgcccgcg cgcgcggctc 211 ccccaacctt taacgttgta aaactttcag cg 6.2.2ITS-2序列：总长度273bp。 2 GB/T25166—2010 1 71 cgcgctccga gtgcacccaa tctcgtgaac gaagcctctc gcgccctgcc gcacagagtt gttgacggcg 141 ctcgcttcgg cggcgactct cgactcacca aacgtgcgcg gggattcgcc tgcttcattc cggctcatgc 211 cttttccccc cccccgcccc cacgcaagtg agggagggag ggaaggagag gccatatcca cac 7检测方法 7.1形态构造特征检验 采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。 7.2染色体检验 7.2.1标本的制备 压片法。 7.2.2染色液 2%地衣红溶于70%的乙酸中。 7.2.3染色方法 固定材料在自来水中浸泡15min~30min后压片。揭开盖片，滴入乙酸地衣红后盖片0.5h，用滤 纸吸出多余的染色液，石蜡封片。 7.3裙带菜ITS序列的检测 7.3.1裙带菜配子体基因组DNA的提取 取约1g（湿重）的裙带菜配子体，加少量石英沙和PVP-40，在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL 的离心管中，加人15mL裂解缓冲液（10mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA，1.0mol/LNaCl, 1.0%CTAB，1%SDS，pH=8.0），在65℃保温1h，期间摇匀几次。用等体积的酚：三氯甲烷：异戊 醇（25：24：1，体积比）抽提两次，再将水相转移至一新的50mL离心管中，加人1/10体积RNA酶， 37℃保温1h，再用三氯甲烷：异戊醇（24：1，体积比）抽提一次，用2/3体积的异丙醇沉淀回收DNA。 DNA最后溶于100μL的TE(10mmol/L Tris-HCl,pH=8.0;1mmol/LEDTA,pH=8.0)中。 7.3.2ITS特异性扩增 总反应体积为20μL，含10mmol/LTris-HCl.pH=8.3,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl2， Taqpolymerase1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4mmol/L~6mmol/L（正向引物P1:5 CGCGAGTCATCAGCTCGCATT-3’；反向引物P2：5'-AGCTTCACTCGCCGTACTGG-3'），模板 DNA10ng，其余用双蒸馏水补满。5C PCR反应参数：96℃预变性5min；96℃，30s；72℃，60s；55℃，30s，37个循环；72℃，保温 5 min。 7.3.3测序 参照DNA测序仪进行测序（参见附录A）。 8判定规则 被检样品完整并符合本标准第4章要求的为合格样品。如被检样品不完整需增加第5章、第6章 内容进行检验，均符合上述质量要求的为合格样品。