ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T14702—2018 代替GB/T14702—2002 添加剂预混合饲料中维生素B6的测定 高效液相色谱法 Determination of vitamin B. in premix- High performance liquid chromatograph 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 14702—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T14702—2002《饲料中维生素B。的测定 高效液相色谱法》。 本标准与GB/T14702—2002相比，主要技术内容修改如下： 标准名称由《饲料中维生素B，的测定 高效液相色谱法》改为《添加剂预混合饲料中维生素 B的测定高效液相色谱法》； 增加了高效液相色谱-荧光检测器的色谱条件（见第7章，2002年版的7.2.2）； 一增加了维生素B，液相色谱-紫外检测器色谱条件下以及液相色谱-荧光检测器色谱条件下的 标准色谱图（见附录A中图A.1和图A.2）。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)]。 本标准主要起草人：李兰、索德成、魏书林。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T14702—1993GB/T14702—2002。 1 GB/T14702—2018 添加剂预混合饲料中维生素B6的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了添加剂预混合饲料中维生素B（盐酸吡哆醇）测定的高效液相色谱法。 本标准适用于维生素预混合饲料和复合预混合饲料中维生素B，的测定。 紫外检测器色谱条件下的定量限为30mg/kg；荧光检测器色谱条件下的定量限为10mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样中维生素B.经酸性提取液超声提取后，注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫 外检测器（二极管矩阵检测器）或者荧光检测器检测，外标法计算维生素B的含量。 4试剂或溶液 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中一级 用水规定 4.1二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：优级纯。 4.2 庚烷磺酸钠（PICB,）：优级纯。 4.3 冰乙酸：优级纯。 4.4三乙胺：优级纯。 4.5甲醇：色谱纯。 4.6 盐酸溶液：取8.5mL盐酸，用水定容至1000mL。 4.7 磷酸二氢钠溶液：3.9g磷酸二氢钠溶于1000mL超纯水中，过0.45μm水系滤膜。 4.8 提取剂：在1000mL容量瓶中，称50mg（精确至0.001g）EDTA（4.1）、依次加入700mL去离子 水，超声使EDTA完全溶解。加人25mL冰乙酸（4.3）、5mL三乙胺（4.4），用去离子水定容至刻度，摇 匀。取该溶液800mL与200mL甲醇混合，超声脱气，待用。 4.9流动相：在1000mL容量瓶中，称50mg（精确至0.001g)EDTA（4.1）、1.1g（精确至0.001g）庚烷 磺酸钠（4.2），依次加入700mL去离子水，25mL冰乙酸（4.3）、5mL三乙胺（4.4），用去离子水定容至 刻度，摇匀。用冰乙酸、三乙胺调节该溶液pH至3.70土0.10，过0.45μm滤膜。取该溶液800mL与 200mL甲醇（4.5）混合，超声脱气，备用。 1 GB/T14702—2018 4.10维生素B标准溶液 4.10.1维生素B，标准贮备液：准确称取维生素B（维生素B纯度大于98%)0.05g（精确至0.0001g）于 100mL棕色容量瓶中，加盐酸溶液（4.6）约70mL，超声5min，待全部溶解后，用盐酸溶液（4.6）定容至 刻度。此溶液中维生素B浓度为500μg/mL，2℃~8℃冰箱避光保存，可使用3个月。 4.10.2维生素B标准工作液A：准确吸取2.00mL维生素B标准贮备液（4.10.1）于50mL棕色容量 瓶中，用磷酸二氢钠溶液（4.7)定容至刻度。该标准工作液中维生素B浓度为20ug/mL,2℃～8℃冰 箱避光保存，可使用一周。 4.10.3维生素B标准工作液B：准确吸取5.00mL维生素B，标准工作液A（4.10.2）于50mL棕色容 量瓶中，用磷酸二氢钠溶液（4.7）定容至刻度。该标准工作液中维生素B，浓度为2.0ug/mL，上机测定 前制备，可使用48h 5仪器设备 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器（二极管矩阵检测器）或荧光检测器。 5.2pH计（带温控，精度为0.01）。 5.3超声波提取器。 5.4针头过滤器：备0.45um水系滤膜 6 试样制备 按GB/T14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195制备试 样，磨碎，通过0.425mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。 7试验步骤 以下操作应避免强光照射。 7.1试样溶液的制备 称取维生素预混合饲料试样0.25g~0.5g（精确至0.0001g）；复合预混合饲料试样2g~3g（精确 至0.0001g），于100mL棕色容量瓶中，加入70mL磷酸二氢钠溶液（4.7）在超声波提取器（5.3）中超 声提取20min（中间旋摇一次以防样品附着于瓶底），待温度降至室温后用提取剂定容至刻度，过滤（若 滤液浑浊则需5000r/min离心5min）。溶液过0.45μm滤膜（5.4），其中维生素B浓度约为2.0μg/ mL~100ug/mL,待上机。 7.2测定 7.2.1高效液相色谱参考条件I 色谱柱：Cis，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能相当的Cis柱。 流动相：见4.9。 流速:1.0 mL/min。 柱温：25℃~28℃ 进样体积：10μL~20μL。 检测器：紫外或二极管矩阵检测器，检测波长290nm。 2 GB/T 14702—2018 7.2.2高效液相色谱参考条件Ⅱ 色谱柱：Cls，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能相当的Cis柱。 流动相：A：磷酸二氢钠溶液（4.7），B：甲醇。梯度淋洗程序参见表1。 表1梯度淋洗程序 时间/min 磷酸二氢钠溶液（A)/% 甲醇(B)/% 0.00 99.0 1.0 88.0 3.00 12.0 6.50 70.0 30.0 12.00 70.0 30.0 12.10 99.0 1.0 18.00 99.0 1.0 流速：1.0 mL/min。 柱温：25℃~28℃。 进样体积：10μL20μL。 检测器：荧光检测器，激发波长293nm；发射波长395nm。 7.2.3 定量测定 （7.1），得到色谱峰面积的响应值，用外标法定量计算。维生素B。荧光检测器色谱图参见附录A。 3试验数据处理 试样中维生素B（盐酸吡多醇）的含量，以质量分数计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式 (1)计算 A, xVxcXVsti w .(1) Asti XmXVi 式中: A: 试样溶液峰面积值； V 试样稀释体积，单位为毫升（mL）； 标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； c 试样溶液进样体积，单位为微升（μL）； Vati 标准溶液进样体积，单位为微升（μL）； Asti 标准溶液峰面积平均值。 试样质量，单位为克（g）； m 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 9 精密度 对于维生素B，含量大于或者等于500mg/kg的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果 GB/T14702—2018 与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。 对于维生素B。含量小于500mg/kg的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术 平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%。 4 GB/T 14702—2018 附录A （资料性附录） 维生素B标准色谱图 液相色谱-紫外检测器色谱条件下维生素B。标准色谱图见图A.1；液相色谱-荧光检测器色谱条件 下维生素B，标准色谱图见图A.2。 060'0 0. 080 维牛素B: 0. 060 0. 050 AU 0. 040 0. 030 0. 020 0.010 0.0007 1min 2. 00 4. 00 6.00 8. 00 10. 00 12.00 14. 0016. 00 18.00 图A.1 FT.D1 A, Ex=293, Em=395 F-11 1 200 维生素B6 1 000 800 600 400 200 0 6 8 10 12 14 16 0 min 4 图 A.2 液相色谱-荧光检测器色谱条件下维生素B标准色谱图（维生素B浓度为18μg/mL） 5