ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T18637—2018 代替GB/T18637—2002 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范 Technical specifications for diagnosis of bovine viral diarrhea / mucosal disease 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 18637—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T18637一2002《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术》，除编辑性修改外，主要技术变 化如下： 一增加了“临床诊断”方法（见第4章）； 一增加了“实时荧光RT-PCR检测”（见5.4）。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国鲁医药品监察所、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、扬州大学、中华人 民共和国宁夏出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国动物卫生与流行病学 中心。 本标准主要起草人：李俊平、刘环、印春生、陶洁、郝俊虎、蒲静、范学政、吴华伟、孙淼、王建华、 宋建德、朱国强。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18637—2002。 1 GB/T186372018 引言 牛病毒性腹泻/粘膜病（BovineViralDiarrhea/MucosalDisease，BVD/MD，简称BVD），是由牛病 牛引起的以发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的 一种传染病。BVDV在分类学上属黄病毒科（Flauiviridae），瘟病毒属（Pestiuirus），是瘟病毒属的代 表种，目前国际病毒分类委员会确定的BVDV有二个基因型（或种），分别是BVDV-1和BVDV-2。它 们与同属的猪瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）及羊边界病病毒（BorderDiseaseVirus， BDV)之间存在着结构与抗原相关性，在血清学上有部分交叉反应。BVDV-1引起的疫病呈全球分布， 较为常见，而BVDV-2引发的疫病不多见。二个基因型的病毒均可根据其在培养细胞上能否产生细胞 病变而被分为二个生物型，即致细胞病变型（Cytopathictype，CP）和非致细胞病变型（Non-cytopathic type,NCP)。NCP毒株是引起所有感染和发病类型的生物型，而CP毒株主要出现在粘膜病病例。 目前，该病在世界范围内广泛流行，我国于1983年首次分离到了BVDV。近年来，病原学调查表明 我国牛、羊、鹿、猪等均不同程度的感染BVDV，该病已严重影响着我国畜牧业的健康发展。 本标准中所描述的方法均为近几年我国在BVD诊断过程中常用的方法，包括临床诊断、病原学诊 断及血清学诊断技术。血清学诊断技术为病毒中和试验。病原学诊断技术包括病毒分离鉴定和实时荧 光RT-PCR(Real-timeRT-PCR)检测方法，本标准中的Real-timeRT-PCR检测方法具有BVDV特异 性，能够同时检测BVDV-1和BVDV-2，且能特异区分BVDV与CSFV。 结合我国动物防疫相关法律、法规和政策，本标准能够有效地诊断和监测我国BVD/MD的发生和 流行。 Ⅱ GB/T186372018 牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范 1范围 本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病的流行病学、临床症状、病理变化等临床诊断，及样品采集与处 理、病毒分离与鉴定、Real-timeRT-PCR检测及病毒中和试验等实验室诊断的技术要求和操作规范 本标准适用于检测不同样品中的1型和2型牛病毒性腹泻/粘膜病病毒、核酸及抗体水平。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BT：牛鼻甲骨细胞（BovineTurbinatecell） BVD/MD：牛病毒性腹泻/粘膜病（BovineViralDiarrhea/MucosalDisease) BVD/MDV：牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（BovineViralDiarrhea/MucosalDiseaseVirus) CPE：致细胞病变效应（CytopathicEffect） CP：致细胞病变型（Cytopathictype) cRNA:互补RNA(ComplementRNA) Ct（Cp）：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阅值所经历的循环数（CycleThreshold，or Crossing Point) DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate) FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein) FBS:胎牛血清(Fetal BovineSerum) FITC：异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate） MDBK：牛肾继代细胞（Madin-DarbyBovineKidneycell) MEM:基础培养基（MinimumEssentialMedium) NCP：非致细胞病变型（Non-cytopathictype） PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline） PBST：吐温磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolutionwithTween20） PI:持续性感染（PersistentInfection） Real-timeRT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-timeReverseTranscriptionPolymerase Chain Reaction) 1 GB/T18637—2018 TCIDso：组织半数感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose） 4临床诊断 4.1流行病学 BVDV可感染各种年龄的牛，青年牛可发生急性感染，怀孕牛极易发生垂直传播。急性感染的牛 病毒血症持续时间较短，表现为一过性排毒，而且排毒量低，在疫病的传播中不起主要作用。怀孕牛感 染可引起流产、胚胎吸收、死胎、先天性缺陷或出生牛特的持续性感染（PI)等。怀孕120天之前先天性 感染的胎牛，出生后往往表现为PI，它们可终身带毒及排毒，是BVDV的主要储存宿主和传播来源。 BVDV的水平传播导致急性感染，主要发生在同牛群内或临近牛群间的相互感染，其中易感牛与 PI牛直接接触是BVDV水平传播的主要途径。 4.2临床症状 4.2.1亚临床感染 在免疫机能健全、血清抗体阴性的牛发生BVDV感染时，70%～90%的牛不表现出明显的眼观临 床症状，即处于亚临床感染状态。可导致温和型发热、白细胞减少症和血清中和抗体的产生，对泌乳期 奶牛可导致产奶量降低。 4.2.2急性感染 急性BVDV感染通常发生在免疫机能健全的青年牛群，以6月龄～24月龄的血清抗体阴性牛常 见。临床症状包括不同程度的高热、厌食、精神沉郁、白细胞减少、眼和鼻腔分泌物增加、口腔溃疡、口腔 脓包和出血、腹泻、呼吸困难以及泌乳期产奶量降低等，在乳房和皮肤交接处及乳头上常见皮肤溃烂。 死亡率不高，个别病牛表现出临床症状后3天～10天死亡。也有一些急性感染的牛不表现明显的临床 症状。发病的严重程度与感染毒株的毒力以及是否继发感染密切相关。 4.2.3严重急性感染 发生严重急性感染时显著特征为高发病率和高死亡率，各种年龄均有发生，表现为高热、肺炎和突 然死亡，怀孕母牛发生流产。血小板减少症和出血性综合征是严重急性BVDV感染的表现形式，感染 牛通常表现为血小板严重减少，粘膜表面淤血、鼻出血、血性腹泻、高热、白细胞减少和死亡等。近年来， 报道的严重急性感染多由NCP的BVDV基因2型毒株所致。 4.2.4持续性感染(PI) 妊娠母牛在怀孕早期（约120天前）感染BVDV后可导致病毒的垂直传播，从而感染胎牛，感染的 胎牛出生后存活下来的大部分特牛都会发展成为PI牛。PI牛是BVDV最主要的储存宿主和传播来 源，可终生带毒并通过尿、粪、分泌物、奶或精液大量排毒。该感染类型无特定的病变，临床差异较大。 有的表现正常，有的衰弱无力，站立和哺乳都困难，也可表现为神经系统缺陷（如肌肉颤抖、共济失调及 失明等），严重的常在出生数日内死亡。为确诊PI牛，对排毒牛需间隔3周后再次检测牛的排毒情况， 如果仍排毒，可以判定为PI牛。 4.2.5粘膜病（MD） MD是BVDV感染引起的一种最严重的临床类型，只发生于PI牛，一般呈散发性，比较少见。其 致病机理是胎儿时期感染了NCP的BVDV毒株的牛，又感染了与此毒株抗原相近的CP株，引发了粘 2 GB/T186372018 膜病。粘膜病主要表现为发病突然、高热、食欲减退、呼吸急促、产奶量降低、大量水血样腹泻。腹泻通 常以出现粘膜排泄、纤维蛋白样物质、血便和恶臭为特征。死亡率非常高。出现MD病例预示着牛群 存在BVDV感染，提示有必要开展流调普查与防控。 4.3病理变化 急性BVDV感染往往导致胃肠道、消化道和呼吸系统的表皮损伤。严重急性感染病牛检时可见 口腔腐烂或溃疡、胃肠表面淤血、溃疡或出血。