ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T15400—2018 代替GB/T15400—1994 饲料中色氨酸的测定 Determination of tryptophan in feeds 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 15400—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T15400—1994《饲料中色氨酸的测定分光光度法》。 本标准与GB/T15400一1994相比，除编辑性修改外，主要技术内容的变化： 增加了高效液相色谱法，修改了适用对象，增加了两个方法的定量限（见第1章，1994年版的 第1章)。 修改了分光光度法原理的表述（见4.1，1994年版的第3章）。 一修改了精密度的表述（见4.7,1994年版的8.3）。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心 （北京）、通威股份有限公司。 本标准主要起草人：李兰、贾铮、赵艳、赵根龙、宋军、张凤秤。 本标准的历次版本发布情况为： GB/T15400—1994。 1 GB/T15400—2018 饲料中色氨酸的测定 1范围 本标准规定了饲料中色氨酸含量测定的高效液相色谱法和分光光度法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定。 高效液相色谱法的定量限为0.02%；当试样最大称样量为700mg，水解液稀释倍数为25倍时，分 光光度法的定量限为0.04%。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6433饲料中粗脂肪的测定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3高效液相色谱法（仲裁法） 3.1原理 试样中的色氨酸经氢氧化锂溶液水解，用高效液相色谱法分离，紫外或荧光检测器检测，外标法 定量。 3.2试剂或材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。 3.2.1水：符合GB/T6682中一级水的规定。 3.2.2甲醇：色谱纯。 3.2.3氢氧化钾溶液（0.1mol/L）：称取0.56g氢氧化钾，溶解于100mL水中，即得。 3.2.4氢氧化锂溶液（4mol/L）：称取83.9g氢氧化锂，溶解于500mL水中，即得 3.2.5乙酸钠缓冲溶液（0.0085mol/LNa+，pH=4.5）：称取0.70g无水乙酸钠，溶解于1000mL水 中，用冰乙酸调节pH为4.5。 3.2.6流动相：乙酸钠缓冲溶液（3.2.5）+甲醇（3.2.2）=95十5。 3.2.7L色氨酸标准储备溶液：准确称取25mg（精确到0.0001g）色氨酸对照品（纯度大于99%），置 于25mL烧杯中，用滴管滴加氢氧化钾溶液（3.2.3）使其溶解，将其定量地转移至250mL棕色容量瓶 中，用水定容，浓度为100μg/mL。2℃～8℃保存，有效期为1个月。 10.00mL、12.50mL、15.00mL、17.50mL分别置于25mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。其 溶液浓度分别为20μg/mL30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL和70μg/mL。2℃~8℃保 存，有效期为2周。 1 GB/T15400—2018 3.3 仪器设备 3.3.1 天平：感量0.0001g、感量0.001g。 3.3.2 聚四氟乙烯水解管：配衬管和密封垫。 3.3.3 恒温干燥箱：可达到110℃士2℃。 3.3.4离心机：转速不低于4000r/min。 3.3.5高效液相色谱仪：配紫外检测器或者荧光检测器。 3.4样品 按GB/T14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195制备试 样，磨碎，全部通过0.25mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，备用。取适量试样，按照GB/T6433测定试 样脂肪含量。 3.5 试验步骤 3.5.1脂肪含量小于4%的试样 平行做两份试验。称取未脱脂试样50mg～100mg（精确至0.0001g），置于聚四氟乙烯水解管 （3.3.2衬管中，加1.5mL氢氧化锂溶液（3.2.4），充氮1min，旋紧密封盖后放人110℃土2℃恒温干 燥箱（3.3.3)中，水解20h。取出水解管，冷却至室温，用乙酸钠缓冲溶液（3.2.5）将水解液定量地转移至 25mL容量瓶中，并用上述缓冲溶液定容，离心或者过0.45um滤膜后上液相色谱仪测定。 3.5.2脂肪含量大于4%的试样 称取脱脂后的试样，按照3.5.1步骤进行水解。 3.5.3参考色谱条件 色谱柱：Cis，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能相当者 流动相：见3.2.6。 流速：1.0mL/min。 柱温：室温。 进样体积：10μL～20μL。 检测器：紫外或二极管矩阵检测器，检测波长280nm。 荧光检测器，激发波长：283nm；发射波长：343nm。 3.5.4测定 按上述规定的色谱条件平衡色谱柱，向色谱柱注入相应的色氨酸标准系列溶液（3.2.8）和试样溶液 （3.5.1或3.5.2），以保留时间定性；在线性范围内，用外标法单点校正定量。色氨酸标准溶液色谱图参 见附录A中图A.1。 3.6 试验数据处理 3.6.1未脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数1计，数值以克每100克表示，按式（1)计算： A,XVXpxVst wi= ×10-4 ..........(1) A.t XmXV. 2 GB/T 15400—2018 式中： A, 试样溶液峰面积值； V 试样稀释体积，单位为毫升（mL）； 色氨酸对照品溶液的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）； Vst 色氨酸对照品溶液进样体积，单位为微升（μuL）； Ast 色氨酸对照品溶液峰面积平均值； m 试样质量，单位为克（g）； Vi 试样溶液进样体积，单位为微升（μL）。 3.6.2脱脂试样中的色氨酸含量以质量分数W2计，数值以克每100克表示，按式（2)计算： A, xVxc XVst ×(1-F) ×10-4 .(2) Ast XmXV 式中： F脂肪含量,%。 式中其他参数同式（1)解释。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留两位小数。 3.7精密度 在重复性条件下，当试样中色氨酸含量小于0.1%时，两次独立测定结果的绝对差值应不天于 0.01%。当试样中色氨酸含量在0.1%～0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不大于 该平均值的3%。当试样中色氨酸含量大于0.5%时，两次独立测定结果与其平均值的绝对差值，应不 大于该平均值的2%。 4分光光度法 4.1原理 饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸。在硫酸介质中、氧化剂亚硝酸钠存在下， 4.2试剂或材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。 4.2.1水：符合GB/T6682中二级水的规定。 4.2.2氢氧化钾溶液（10%）：称取100g氢氧化钾，溶解于1000mL水中，即得 4.2.3硫酸溶液（21.2mol/L）：量取589mL硫酸，缓慢加人约350mL水中，冷却后用水稀释至1L。 用现配。 4.2.5亚硝酸钠溶液（0.2%）：称取0.1g亚硝酸钠，溶解于50mL水中，临用时制备。 4.2.6L-色氨酸标准储备溶液：同3.2.7。 4.2.7L-色氨酸标准系列溶液：同3.2.8。 4.3仪器设备 4.3.1天平：同3.3.1。 4.3.2培养箱：40℃±2℃。 4.3.3离心机：同3.3.4。 3 GB/T15400—2018 4.3.4分光光度计，配1cm比色皿。 4.4样品 同3.4。 4.5试验步骤 4.5.1试样的水解 4.5.1.1脂肪含量小于4%的试样 平行做两份试验。参考附录B中表B.1的称样量，称取试样0.16g～0.7g（精确至0.0001g）于 50mL容量瓶中，在轻轻振摇中缓慢加入25mL氢氧化钾溶液（4.2.2），使试样湿润且不粘壁，置于培 养箱（4.3.2）中水解16h～18h。取出水解液冷却至室温，用水定容至刻度，摇匀。取部分水解液以 4000r/min转速离心15min，备用。 4.5.1.2脂肪含量大于4%的试样 称取脱脂后的试样，按照4.5.1.1步骤进行水解。 4.5.2显色反应 4.5.2.1L-色氨酸标准系列溶液的显色 精密移取水和L-色氨酸标准系列溶液（4.2.7)各浓度溶液1mL，分别置于10mL具塞试管中，水为 试剂空白。向每支试管内加入氢氧化钾溶液（4.2.2)1mL，混匀。将试管放人冷水盆中，加5mL对二 甲氨基苯甲醛溶液（4.2.4），从冷水盆中取出试管摇匀，在20℃～30℃放置30min。向每支试管内加 入0.2mL亚硝酸钠溶液（4.2.5），摇匀，放置25min。 4.5.2.2试样溶液的显色 取2mL试样溶液（4.5.1.1或4.5.1.2）置于10mL具塞试管中，并将试管放入冷水盆中，加5mL对 二甲氨基苯甲醛溶液（4.2.4），从冷水盆中取出试管，摇勾。再从每个试样溶液中另取2mL置于10mL 具塞试管中，加5mL硫酸溶液（4.2.3）作为样品空白，摇匀。从冷水盆中取出试管，在20℃～30℃下 放置30min。向每支试管内加入0.2mL亚硝酸钠溶液（4.2.5），摇匀，放置25min。 4.5.3比色