ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 13091—2018 代替GB/T13091—2002 饲料中沙门氏菌的测定 Determination of Salmonella infeeds 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T13091—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T13091—2002《饲料中沙门氏菌的检测方法》。 本标准与GB/T13091一2002相比，除编辑性修改外，主要变化如下： 删除了术语和定义（见2002年版的第3章）； 删除了原理（见2002年版的第4章）； 增加了试验程序图（见附录A图A.1)； 一修改了增菌器具，并增加了均质袋及均质器选项（见6.1，2002年版的9.1.2）； 基”（见6.3，2002年版的9.4）； 修改了鉴定流程和鉴定表（见6.4，2002年版的9.5）； 一增加了“利用三糖铁试验和赖氨酸脱羧酶试验进行初步判断”步骤（见6.4.1)； 增加了“生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统”进行沙门氏菌鉴定选项（见6.4.3）。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心 (北京）。 本标准主要起草人：饶正华、刘晓露、樊霞 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T13091—1991,GB/T13091—2002。 GB/T 13091—2018 饲料中沙门氏菌的测定 1范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的检验方法， 540 本标准适用于饲料和饲料添加剂中沙门氏菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 培养基或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 3.1 水：应符合GB/T6682中三级水的要求。 3.2 缓冲蛋白陈水(BPW)：见附录B中B.1。 3.3 氯化镁孔雀绿(RV)增菌液：见附录B中B.2。 3.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：见附录B中B.3。 3.5 亚硫酸铋(BS)琼脂：见附录B中B.4。 3.6 胆硫乳(DHL)琼脂：见附录B中B.5。 3.7 沙门氏菌属显色培养基。 3.8 营养琼脂(NA)：见附录B中B.6。 3.9 三糖铁琼脂(TSI)：见附录B中B.7。 3.10 蛋白陈水、靛基质试剂：见附录B中B.8。 3.11 尿素琼脂(pH7.2):见附录B中B.9。 3.12 氰化钾(KCN)培养基：见附录B中B.10。 3.13 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录B中B.11 3.14 糖发酵管：见附录B中B.12。 3.15 邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG)培养基：见附录B中B.13。 3.16 半固体琼脂：见附录B中B.14。 3.17 丙二酸钠培养基：见附录B中B.15。 3.18 沙门氏菌因子O和H多价诊断血清，Vi因子诊断血清。 4 仪器设备 4.1 冰箱：2℃~5℃。 4.2 恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。 4.3 均质器。 4.4 振荡器。 1 GB/T13091—2018 4.5 电子天平：感量0.1g。 4.6无菌锥形瓶：容量500mL、250mL，或无菌均质袋。 4.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 4.8无菌培养皿：直径60mm，90mm。 4.9无菌试管:3mmX50mm、10mmX75mm。 4.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。 4.11全 全自动微生物生化鉴定系统。 5样品 5.1采样原则 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来 污染。 5.2采样方法 5.2.1应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于 500 g(mL). 5.2.2独立包装不大于500g的固态产品或不大于500mL的液态产品，取完整包装 5.2.3独立包装大于500mL的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集 适量样品，放人无菌采样容器内作为一件样品 5.2.4独立包装大于500g的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放 入同一个无菌采样容器内作为一件样品。 5.3 采集样品的贮存和运输 5.3.1 应尽快将样品送往实验室检验， 5.3.2应在运输过程中保持样品完整。 5.3.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。 6试验方法（试验程序图见附录A) 6.1前增菌 无菌条件下称取25g（mL）样品，加人装有225mL灭菌BPW的500mL无菌锥形瓶内，置于振荡 器中，以8000r/min~10000r/min振荡2min～3min；若样品为液态，振荡混匀即可。36℃士1℃培 养 18 h±2 h。 注：可用无菌均质袋代替锥形瓶，然后用均质器拍打2min～3min，但有坚硬或棱角的样品不能够使用均质袋，只 能使用锥形瓶，以防均质和增菌过程中均质袋破裂泄漏，造成污染。 6.2选择性增菌 前增菌培养物摇匀后，取1mL接种于装有10mLRV的试管中，于42℃土1℃培养18h～24h。 另取前增菌培养物1mL，接种于装有10mLSC的试管中，36℃土1℃培养18h～24h。 6.3分离培养 用接种环取1环选择性增菌液，划线接种于BS琼脂平板上，于36℃士1℃培养40h48h。另取 2 GB/T13091—2018 1环选择性增菌液，划线接种于DHL琼脂平板或沙门氏菌显色培养基平板上，36℃土1℃培养18h～ 24h，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表1。 表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌菌落特征 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌 亚硫酸铋(BS)琼脂 株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变 胆硫乳(DHL)琼脂 菌落为无色半透明或粉红色，菌落中心黑色或几乎全黑色 沙门氏菌属显色培养 按照显色培养基的说明进行判定 6.4生化试验 6.4.1 从选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于 底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃土1℃培养 18h～24h，必要时可延长至48h。三糖铁琼脂培养基特征变化见表2。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶 试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表3。 表2三糖铁培养基特征变化表 说明 培养基部位 培养基变化 黄色 乳糖和燕糖阳性 斜面和底部 红色或不变色 乳糖和蔗糖阴性 底端黄色 葡萄糖阳性 红色或不变色 葡萄糖阴性 底部 穿刺黑色 形成硫化氢 SNG 气泡或裂缝 葡萄糖产气 表3沙门氏菌属在三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 K A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌 K A +(-) +(-) 可疑沙门氏菌 A A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌 A A +/- +/- 非沙门氏菌 K K +/- +/- +/- 非沙门氏菌 注：K,产碱；A,产酸；十，阳性；一，阴性；十（-），多数阳性，少数阴性；十/一，阳性或阴性。 尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接 种。于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室 3 GB/T13091—2018 温至少保留24h，以备必要时复查。 表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢（H,S) 靛基质 pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN) 赖氨酸脱羧酶 A1 + + A2 + + + A3 +/- 注：十阳性；一阴性；十/一阳性或阴性。 根据表4对结果进行判定，具体如下： 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异 a) 常，按表5可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。 表5沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氙化钾 赖氨酸脱羧酶 判定结果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） + + 沙门氏菌IV或V（要求符合本群生化特性） + + 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：十阳性：一阴性；十/一阳性或阴性。 b) 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体的两项试验结果均为阳性， 但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 反应序号A3：补做ONPG试验。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤 寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 d) 必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表6 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 I II IV V VI 卫矛醇 + + + 山梨醇 + + + + + 水杨苷 ONPG + 丙二酸盐 + + KCN + + 注：十表示阳性；一表示阴性。 6.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据6.4.1的初步判断结果，从营养琼 脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或