ICS 07.080 C 27 中华人民共和国国家标准 GB/T 36757—2018 M-MLV反转录酶 M-MLV reverse transcriptase 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36757—2018 目 次 前言 引言 IN 范围 1 2 规范性引用文件 3术语和定义 技术要求 4 5 检验方法 6包装、运输及贮存· 保质期 7 附录A（规范性附录） M-MLV反转录酶酶活力检测 附录B（规范性附录） 核酸外切酶检测 附录C(规范性附录) 核酸内切酶检测 GB/T 36757—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶标准化工作组（SAC/SWG11)归口。 本标准起草单位：中国科学院微生物研究所、厦门致善生物科技股份有限公司、福建华灿制药有限 公司、福建南生科技有限公司、安琪酵母股份有限公司、上海博仕生物医学服务中心、北京化工大学。 本标准主要起草人：李晶、宋娜杰、黄发灿、刘文军、詹学雄、郑登忠、李庆阁、赵晶、章丽丽、姚鹃、 邢志刚、陈劲春。 Ⅲ GB/T36757—2018 引 M-MLV反转录酶（M-MLVReverseTranscriptase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成 互补DNA（cDNA)的酶，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转 录反应。制定M-MLV反转录酶国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于M-MLV反转录酶的 生产和使用具有重要意义。 IV GB/T 36757—2018 M-MLV反转录酶 1范围 本标准规定了M-MLV反转录酶的技术要求、检验方法、包装、运输和贮存 本标准适用于通过基因重组表达中提取的M-MLV反转录酶 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 M-MLV反转录酶 每M-MLV reverse transcriptast 以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。 3.2 M-MLV反转录酶活性单位 activity unit of M-MLV reverse transcriptase 以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物，在37℃，18.67min内，将0.105nmol脱氧核苷酸 聚合成双链DNA中所需的酶量为50活力单位。 4 技术要求 SA 4.1 外观 澄清透明的液体，无沉淀。 4.2 酶活力 ≥200 U/μL。 4.3 3杂质 不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。 5 检验方法 5.1 外观 直接或将样品倒人无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。 1 GB/T36757—2018 5.2 2酶活力 依据附录A的方法进行检测。 5.3 杂质 5.3.1核酸外切酶 依据附录B的方法进行检测。 5.3.2核酸内切酶 依据附录C的方法进行检测。 包装、运输及贮存 9 6.1 包装 内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定。 6.2 运输 产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防 护措施避免倒置及破损。不宜与有毒、有害、有异味物品混运。 6.3 3贮存 应在温度低于一20℃的条件下储存。 7 保质期 在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为三年；超过保质期，使用前应检测酶 活力。 2 GB/T 36757—2018 附录A （规范性附录） M-MLV反转录酶酶活力检测 A.1仪器设备 荧光PCR仪。 A.2试剂 A.2.1 发夹型寡核苷酸序列（T2），序列为： 5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3' A.2.2 dNTP。 注：dGTP：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸；dATP：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸；dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸； dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。dNTP：三磷酸碱基脱氧核苷酸，包括dGTP、dATP、dTTP、dCTP。包括 dCTPdATP.dTTPdGTP。 A.2.3荧光核酸染料。 A.2.4LamdaDNA标准品。 A.3试剂溶液配制 A.3.11×TE溶液：10mmol/LTris-HCl,1mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，pH8.5（25℃）。 A.3.2PCR缓冲液:500mmol/LTris-HCl,750mmol/L氯化钾溶液，100mmol/LDTT,pH8.5 (25 ℃)。 A.3.3LambdaDNA预染液：以8.5μL：1μL：0.5μL的比例分别量取纯化水、10XPCR缓冲液和荧 光核酸染料加人离心管，在漩涡混匀器上振荡混匀1min后在微型离心机上离心数秒，储存于2℃~ 8℃。 A.3.4 氯化镁溶液：25mmol/L。 A.3.5酶稀释缓冲液：10mmol/LTris-HCl,0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，1mmol/LDTT， 50%（体积分数）甘油，pH8.0（25℃）。 A.3.6T2溶液：将发夹型寡核苷酸序列（T2）干粉按照合成单上的说明稀释到100umol/L，储存于 一20℃。使用时从一20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒。 A.3.7dNTP混合液：将dNTP中的dCTP、dATP、dTTP、dGTP等体积进行混合，于漩涡混匀器上混 匀10s，在微型离心机上离心数秒，配制成浓度为25mmol/L的dNTP混合液。 A.3.8LambdaDNA标准品：使用1×TE溶液将LambdaDNA标准品进行4倍连续梯度稀释，得到 100μg/mL.25μg/mL.12.5μg/mL.6.25μg/mL3.125μg/mL、1.5625μg/mL和0.78125μg/mL的 8个浓度梯度溶液，以相同体积的1×TE溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积 的预染液，于漩涡混匀器上混匀10S，在微型离心机上离心数秒，以20μL/管分装于PCR八联管内，每 个梯度3个重复，盖紧管盖，在微型离心机上离心数秒后备用。 3.