ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36770—2018 澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Australian grapevine viroid 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36770—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：邓丛良、张永江、王英超、向均、赵晓丽、谢丽雪 GB/T36770—2018 澳洲葡萄类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了澳洲葡萄类病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有澳洲葡萄类病毒的葡萄繁殖材料的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 澳洲葡萄类病毒基本信息 学名：Australian grapevine viroid 缩写：AGVd 异名：澳大利亚葡萄类病毒 分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae）、苹果锈果类病毒属（Apscaviroid） 澳洲葡萄类病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列。主要的方法有反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和核酸分子 杂交。 仪器设备、主要用具和主要试剂 5 5.1仪器设备 电子天平（感量0.001g）、普通天平（感量0.1g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱（一80℃）、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光定量PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒 温水浴锅、组织破碎仪等。 S 5.2主要用具 可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，200μL，1000μL，5000μL）、无RNA酶吸头（10μL， 20μL，200μL，1000μL，5000μL）、无RNA酶离心管（1.5mL，5mL，10mL）、研钵、研棒、磁性分 离架、PCR反应管（200μL）、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片。 5.3主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。普通RT-PCR检 1 GB/T36770—2018 测试剂见附录B；实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D。 检测与鉴定 6 6.1 普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法见附录B。 6.2 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法见附录C。 6.3 3斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录D。 7结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性，则判 定为检出AGVd 样品经普通RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的AGVd序列一致，则判定为检出 AGVd. 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性，且序列测定结果与已知的AGVd序列一致，则判定为检出 AGVd。 A8样品保存与结果记录 8.1样品保存 完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验 人员的签字；普通RT-PCR检测结果保存电泳照片及测序结果；实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光 曲线图及Ct值；斑点杂交检测保存照片。 8.2 2样品保存与处理 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月，种子保存在4℃冰箱内，生长苗木或插条保存在隔 离温室中培养，叶片、果实等样品在一80℃冰箱内保存。对检出澳洲葡萄类病毒的样品应至少保存 6个月，以备复核、谈判和仲裁。保存期满后，应灭活处理。 2 GB/T36770—2018 附录A （资料性附录） 澳洲葡萄类病毒相关资料 A.1寄主范围 自然条件下侵染葡萄（Vitisvinifera）。 A.2 病害症状 寄主受AGVd侵染后，多表现隐症。 A.3 分布地区 澳大利亚、美国、突尼斯、中国。 A.4 传播方式 AGVd主要通过嫁接传播和机械传播，也可通过种子传播。 A.5 基因组 AGVd为单链环状的RNA分子，长369个核苷酸残基。 SzC 3 GB/T36770—2018 附录B （规范性附录） 普通RT-PCR检测方法 B.1 主要试剂 B.1.11mol/L磷酸氢二钾（K,HPO.） 17.42 g 磷酸氢二钾 加双蒸水定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.2 2.5mol/L磷酸氢二钾（KzHPO4） 43.55 g 磷酸氢二钾 加双蒸水定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.33mol/L乙酸钠(NaAc)(pH 5.2) 三水乙酸钠 40.83 g 用3mol/L乙酸调节pH至5.2，用双蒸水定容至100mL，高压蒸汽灭菌。 B.1.44 mol/L氯化锂(LiCI) 氯化锂 16.96 g 加双蒸水定容至100mL。用0.22um滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。贮存于4℃。 B.1.5 研磨缓冲液 异硫氰酸胍（GITC) 4 mol/L 十二烷基肌氨酸钠 5 g/L 曲拉通X-100(TritonX-100) 0.1%（体积分数） 氯化钠（NaCI） 10 mmol/L 柠檬酸钠缓冲液（pH7.0) 25 mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 20 g/L B.1.6 50×TAE缓冲液 Tris碱 242 g 冰乙酸 57.1 mL 乙二胺四乙酸(EDTA)(0.5 mol/L,pH 8.0) 100 mL 加双蒸水定容到1L。 B.1.7 6×Loading缓冲液 溴酚蓝 2.5 g/L 二甲苯青FF 2.5 g/L 燕糖水溶液 400 g/L 4 GB/T 36770—2018 贮存于4℃。 B.2引物序列 正向引物 AGVdF:5'-ACCTGCAGGGAAGCTAGCTGGGTC-3'; 反向引物AGVdR:5'-CCCTGCAGGTTTCGCCAGCAAGCGC-3'; 扩增片段大小为369bp。 B.3试验步骤 B.3.1RNA的提取 B.3.1.1方法一(LiCI方法) 取1g叶片样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移人10mL离心管中，并加入2mL1mol/L 磷酸氢二钾和8μL巯基乙醇，混勾，再加人2mL水饱和酚：氯仿（体积比为1：1），涡旋1min，充分混 匀；4℃，10000g离心10min。取上层液体，加入同体积的水饱和酚：氯仿（体积比为1：1），充分混 匀；4℃，10000g离心10min。取上层液体，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀；一20℃下放置 2h~4h或-80℃下放置至少30min；4℃，10000g离心10min。取沉淀，加1mL无RNA酶的水 匀；4℃，12000r/min离心10min。取上层液体，加人无RNA酶的水至10mL，再加入100μL20g/L 的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)溶液，充分混勾，冰浴3h～4h；4℃，10000g离心10min。取沉淀， 加入2mL无RNA酶的水充分溶解后，加入5mL无水乙醇、0.2mL3mol/L乙酸钠（pH5.2），充分混 匀，一20℃下放置至少2h；4℃，10000g离心10min。取沉淀，加200μL无RNA酶的水反复吹打， 待沉淀充分溶解后，将溶解物移人1.5mL离心管中；加人200μL4mol/L氯化锂，充分混匀，冰浴至少 4h；4℃，10000g离心10min。取上层液体于1.5mL离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀， 一20℃下放置至少2h或一80℃下放置至少30min；4℃，10000g离心10min。取沉淀，70%乙醇 清洗沉淀；4℃，10000g离心2min；取沉淀，待其干燥后，加人50uL～60μL无RNA酶的水充分溶 解，一20℃下保存备用。 B.3.1.2方法二(CTAB方法） 取0.1g样品，加液氮研磨成粉未状，将研磨物迅速移入1.5mL离心管中，加入加入预热的CTAB 提取缓冲液900uL，以及2%的琉基乙醇，颠倒混匀，65℃孵育10min，加人等体积的氯仿：异戊醇 离心10min；取上清，加入10mol/L的氯化锂至终浓度3mol/L，冰浴30min，4℃，12000g离心 20min；弃上清，加入65℃预热的SSTE缓冲液500μL溶解沉淀，以及等体积的氯仿：异戊醇（24+ 1），混匀；4℃，11000g离心10min，取上清移人1.5mL离心管，加人700μL预冷的异丙醇，一20℃ 沉淀30min。4℃，12000g离心20min；沉淀用70%乙醇洗涤两次，4℃，12000g离心2min；去除 上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30μL～50μL无RNA酶的水中。 B.3.1.3方法三（纳米磁珠方法） 5