ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36775—2018 柑橘斑点病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudocercospora angolensis Crous & U.Braun 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36775—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局 本标准主要起草人：冯黎霞、胡学难、左然玲、武目涛、王卫芳、赵立荣、于璇 GB/T36775—2018 柑橘斑点病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中柑橘斑点病菌的检疫鉴定方法， 本标准适用于柑橘属苗木和果实上柑橘斑点病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 3方法原理 柑橘斑点病菌分类、分布及寄主信息参见附录A。本标准以该病原菌寄主危害症状、形态学特征、 培养特性作为主要检疫鉴定依据，致病性测定作为柑橘斑点病菌的辅助检疫鉴定依据 4设备用具 4.1仪器设备 体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、电子天平（感量0.01g）、生物培养箱。 4.2实验用具 标签、定性滤纸、样品袋、保鲜袋、手持放大镜、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种针、 培养血、烧杯、量筒、三角瓶、玻棒、微量移液器（可调试范围2.5μL～1000μL）、pH计。 5试剂和培养基 5.1试剂 无水乙醇、0.5%次氯酸钠（NaOCI)溶液、碳酸钙（CaCO：）无菌双蒸水。 5.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)：称取200g马铃薯，15g葡萄糖，15g琼脂。马铃薯去皮切成小 块后加水煮沸20min～30min，纱布过滤后加入15g琼脂，溶化后加人15g葡萄糖，去离子水补足 1000mL,将培养基的pH值调至5.6,121℃灭菌20min。也可采用商品化PDA粉按使用说明进行 配制。 V8培养基（V8A）：100mLV8蔬菜汁，碳酸钙0.2g，琼脂粉150g，去离子水补足1000mL121℃ 1 GB/T367752018 灭菌20 min。 配制培养基时，遵循SN/T1538.1的要求。 6检疫鉴定方法 6.1现场查验 仔细检查植株或果实是否有附录A中表述的危害症状，采集的有疑似症状样品保存无菌透明塑料 袋中，粘贴标签后冷藏保存，以备进一步分离。 6.2 实验室鉴定 6.2.1直接镜检 如病枝或病果表面有明显病征，可直接在体式显微镜下观察记录病斑的细微特征，包括病斑的形 态、大小和颜色。挑取病部分生孢子梗、分生孢子制成玻片，置于生物显微镜下镜检，观察记录分生孢子 梗、分生孢子的颜色和形态特征。 6.2.2保湿培养 如病叶、病果和病枝上只有可疑病状而无明显病征，则将病叶、病果或病枝（截成5cm）置于样品袋 中，25℃保湿培养，观察症状变化， 6.2.3分离培养 后用无菌滤纸吸十表面水分，放置于PDA平板上。每个PDA平板放置4块～6块样品组织，24C～ 28℃条件下保湿培养。培养5d～7d,用无菌接种针从菌落边缘挑取菌丝块置于V8培养基上进行纯 化培养30d，培养条件为12h光亮，12h黑暗。定期观察记录菌落的形态、颜色、大小和质地、分生孢子 颜色和形态特征，疑似菌株转到PDA培养基上纯化3次，保存备用。 6.2.4致病性测定 将纯分离物作为供试菌株用伤口接种法接种幼嫩新鲜柑橘果实（果龄1周～3周为佳）。首先供试 菌株在PDA平板上于25℃条件下12h光亮、12h黑暗培养30d，然后挑取菌落上的分生孢子，用无菌 水制成孢子悬浮液（孢子浓度为3.0×10°/mL）。用70%乙醇对供试柑橘果实表面消毒。用无菌刀片 菌湿润的滤纸盖在伤口处保湿，放入样品袋中，置于25℃下保湿培养。每个菌株接种柑橘不少于10 个。定期观察接种果实的发病情况，发病后按照6.2.3方法分离病菌，对病菌形态鉴定 7鉴定特征 7.1 症状 叶片上具黄绿色病斑，叶斑病菌两面生，病斑直径4mm～10mm左右，幼嫩叶片病斑常表现黄萎 2 GB/T36775—2018 坏死，严重时，叶片脱落；果实病斑圆形至不规则形，离散或联合，最大直径可达3cm～4cm，嫩果症状 常从增生产生瘤状病斑开始，边缘有黄色晕圈，成熟果实的病斑一般是平坦的，病部木栓化（症状图参见 附录B图B.1)。 7.2菌落特征 在V8培养基平板上24℃～28℃培养30d后，菌落平铺，呈灰白色，气生菌丝旺盛，绒毛状。培养 后期，从菌落中央开始变成灰橄榄色，黑灰色至黑色，逐渐菌落边缘菌丝体颜色也逐渐加深，菌落中央隆 起，质地逐渐变硬，炭质，表面凹凸不平，菌落背面为深墨绿色。 7.3病菌形态 生孢子梗单生、丛生或形成分散的宽的联丝体，无分枝，直径为12um～45um，通常从子座上长出，子 座直径为30um～60um。分生抱子顶生或顶侧生，单生或2个～4个多抱链状生，平滑，透明至浅褐 色，圆柱形或稍弯，顶部圆形，基部稍平钝至弧形弯曲，1个～6个（通常3个～4个）分隔，23um～ 87um长，分生孢子4μm~5μm（4μm~6.5μm）宽，基部2μm~3μm宽。产孢细胞末端具轻微膝状 弯曲，产孢位置具明显的孢痕疤，但不增厚（病菌形态特征图参见附录C图C.1）。 7.4致病性测定 分离得到的病菌分离物得到柯赫氏法则验证。即以柑橘果实为接种材料，利用6.2.4方法接种30d 后，柑橘果实出现干腐、组织硬化等症状。从病部得到的分离物培养特征、形态特征与供试接种菌株 一致。 8结果判定 符合下列任一种情况均可判定为检出柑橘斑点病菌： 如果病部有明显的病状和病征，进行分离培养后，病菌形态学特征和菌落特征与7.1和7.2吻合。 如果病部有病状但无病征，经保湿培养和（或）分离培养所产生的病菌形态学特征和菌落特征与 7.1、7.2吻合，致病性测定结果符合7.4。 SAC 9样品和资料的保存 9.1样品的保存 检验为阳性的样品标注来源、寄主、分离时间、鉴定人后置于4℃冰箱保存；病菌纯培养菌株在含 20%甘油的冻存管中一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃ 下保存，并定期（约180d）转管。 对鉴定为柑橘斑点病菌的样品至少保存6个月，以备复核谈判和仲裁，样品保存期满后，需无害化 处理。 3 GB/T36775—2018 9.2 检验资料的保存 妥善保存检验资料，以备复核、谈判和仲裁。检验报告应注明检验时间、方法和结果等，并有检验检 疫员的签名；检验图片包括症状、病菌等。 510 4 GB/T36775—2018 附录A （资料性附录） 柑橘斑点病菌技术性资料 A.1柑橘斑点病菌的基本信息 学名: Pseudocercospora angolensis (T. Carvalho &, O. Mendes)Crous & U. Braun 2003 同物异名：Cercospora angolensis T.Carvalho &.O.Mendes1953 Phaeoramularia angolensis (T. Carvalho & O. Mendes)P.M. Kirk 1986 Pseudophaeoramularia angolensis (T. Carvalho &. O. Mendes)U. Braun 1999 英文名:Pseudocercospora fruit and leaf spot （PFLS)，Angular leaf spot of Citrus，Citrus fruit leaf spot 分类地位：子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），座囊菌纲（Dothideomycetes），座 囊菌亚纲（Dothideomycetidae），煤目（Capnodiales），球腔菌科（Mycosphaerellaceae），假尾孢属 (Pseudocercospora)。 A.2寄主 斑点病菌可以侵染绝大多数的柑橘属植物，包括：加蓬樱桃橘（Citrusgabunensis）、青柠（C.auran tiifolia）、来檬（C.aurantium）、温州蜜柑（C.unshiu）、柑橘（C.deliciosa）、酸橙（C.latifolia）、柠檬 （C.limon）、柚（C.marima）、枸檬（C.medica）、橘柚（C.paradisi）、橙（C.sinensis）、粗柠檬（C.jamb- hiri)金柑（Fortunellajaponica）。 A.3分布 非洲：安哥拉、冈比亚、喀麦隆、中非、加蓬、几内亚、莫桑比克、尼日利亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦、 刚果、刚果民主共和国、科特迪瓦、多哥、布隆迪、肯尼亚、科摩罗、坦桑尼亚、埃塞俄比亚、加纳、卢旺达 塞拉利昂。 亚洲：也门。 A.4病害侵染循环 柑橘斑点病菌病喜潮湿温暖的天气，在雨季来临之初，通过分生孢子侵人叶和果进行危害，该病菌 可在叶片上完成一个侵染循环，适宜发生的温度在22℃～26℃。柑橘斑点病菌以菌丝体在病残体上 受侵染的叶子上的病斑又产生孢子，经过5周～8周，传播到新叶上。 在非洲，该病主要发生在海拔80m～1