ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36781—2018 瓜类种传病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of cucurbit seed transmitted viruses 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36781—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 局、中国农业科学院郑州果树研究所、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈红运、陈青、陈林、廖富荣、方志鹏、黄峰、古勤生、张永江、林石明。 GB/T367812018 瓜类种传病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了瓜类作物上5种常见种传病毒一黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumbergreenmottle mosaicvirus，CGMMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、甜瓜坏死斑病毒（Melonnec- roticspotvirus，MNSV）、南瓜花叶病毒（Squashmosaicuirus，SqMV）和小西葫芦黄花叶病毒 （Zucchiniyellowmosaicoirus，ZYMV）的检测方法，规定了马铃薯Y病毒科（Potyoiridae）、烟草花叶 病毒属（Tobamouirus）和南方菜豆花叶病毒属（Sobemouirus）的分子鉴定方法。 本标准适用于西瓜（Citrullusvulgaris）、甜瓜（Cucumismelo）、黄瓜（Cucumissatiuus）、南瓜（Cu curbitamoschata）、瓜（Lagenariasiceraria）、西葫芦（Cucurbitapepo）、笋瓜（Cucurbitamarima）、 苦瓜（Momordicacharantia）和丝瓜（Luffacylindrica）等瓜类作物种子的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3原理 血清学特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。瓜类种传病毒的相关背景资料参见附录A。 4 仪器、试剂及耗材 4.1仪器与用具 酶标仪、洗板机、PCR仪、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机、电子天平、电泳 仪、电泳槽、微量移液器、研钵等。 4.2 2试剂与耗材 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂见附录B，RT-PCR检测试剂见附录C。各种规格的吸头、离心 管、酶标版、PCR管等。 5检疫与鉴定 5.1抽样 按照SN/T2122的规定执行。 5.2制样 将种子播于灭菌土中，待长出3片～4片真叶后，将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株 1 GB/T36781—2018 分组（10株为1组）编号。采集真叶，将采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联免疫测定和分子 检测。 注：也可直接检测种子。 5.3检测 5.3.1病毒种类 瓜类种子检测的病毒种类见表1。 表1瓜类种子检测的病毒种类 瓜类寄主 病毒种类 黄瓜绿斑驳花叶病毒 苦瓜 黄瓜花叶病毒 黄瓜绿斑驳花叶病毒 黄瓜花叶病毒 南瓜属（南瓜、西葫芦、笋瓜） 南瓜花叶病毒 小西葫芦黄花叶病毒 黄瓜绿斑驳花叶病毒 瓜 黄瓜花叶病毒 黄瓜绿斑驳花叶病毒 丝瓜 黄瓜花叶病毒 黄瓜绿斑驳花叶病毒 黄瓜花叶病毒 甜瓜属（甜瓜、黄瓜） 甜瓜坏死斑病毒 南瓜花叶病毒 小西葫芦黄花叶病毒 黄瓜绿斑驳花叶病毒 西瓜 黄瓜花叶病毒 甜瓜坏死斑病毒 5.3.2ELISA检测 ELISA检测见附录B。ELISA测定结果为阳性的样品需进行RT-PCR验证。 注：也可不经过ELISA初筛检测，直接进行RT-PCR检测， 5.3.3RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物样品作阴性对 照，感染特定病毒的植物样品作阳性对照，用水作空白对照。 具体操作见附录C。 5.3.4病毒科/属的鉴定 如显症植株针对特定病毒（CMV,CGMMV,MNSV,SqMV,ZYMV)的检测结果为阴性，应对其进 2 GB/T367812018 行病毒科/属的分子鉴定。马铃薯Y病毒科、烟草花叶病毒属和南方菜豆花叶病毒属的分子鉴定方法 见附录D。 6 结果判定 6.1 特定病毒的结果判定 酶联测定和RT-PCR检测结果均为阳性，判定检出特定的病毒。 采用RT-PCR直接检测样品时，扩增出预期大小的条带时，判定检出特定的病毒。 注：必要时，可进一步测序验证。 6.2病毒科/属的结果判定 样品扩增出预期大小的条带，且测定的序列为相应病毒科/属的序列时，判定检出相应病毒科/属成 员。否则判定未检出。 结果记录 据，RT-PCR检测应有电泳图片，必要时需附上测序结果。 8 样品保存 经检验确定携带病毒的样品应在合适条件下保存，种子保存在4℃，病株在一20℃或者一80℃冰 箱中保存，做好标记和登记。 3 GB/T 36781—2018 附录A （资料性附录） 瓜类种传病毒特性 A.1病毒种类 瓜类作物上的种传病毒见表A.1。 表 A.1 瓜类作物上的种传病毒 序号 病毒名称 科 属 分布地区 英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、 印度、沙特阿拉伯、丹麦、德国、 黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber 植物杆状病毒科 烟草花叶病毒属 俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、 green mottle mosaic virus,CGM- Virgaviridae Tobamovirus 爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、 MV) 韩国、朝鲜、以色列、波兰、日本、 巴基斯坦、中国 黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaic 雀麦花叶病毒科 黄瓜花叶病毒属 2 广泛分布 virus,CMV) Bromoviridae Cucumovirus 甜瓜坏死斑病毒（Melonnecrotic 番茄丛矮病毒科 麝香石竹斑驳病毒属 日本、美国、希腊、瑞典、意大利、 3 spot virus,MNSV) Tombusviridae Carmovirus 突尼斯、中国局部 南瓜花叶病毒（Squashmosaic 伴生豆病毒科 虹豆花叶病毒属 广泛分布 4 wirus,SqMV) Secoviridae Comovirus 小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini 马铃薯Y病毒科 马铃薯Y病毒属 广泛分布 yellow mosaic virus,ZYMV) Potyviridae Potyvirus A.2基因组特征 A.2.1 马铃薯Y病毒科 马铃薯Y病毒科包括8个病毒属，除了大麦黄花叶病毒属为二分体粒子外，其他7个病毒属均为 单分体粒子。马铃薯Y病毒属（Potyoirus）是马铃薯Y病毒科中最大的病毒属，有146种病毒。Poty virus病毒粒子为弯曲线状，长度为650nm～900nm，直径11nm～15nm。基因组为1条正义 ssRNA,长度 8.5kb~12 kb。 A.2.2烟草花叶病毒属 病毒粒子长直杆状，长度300nm～310nm，直径18nm。基因组为1条正义ssRNA，长约6.4kb A.2.3豇豆花叶病毒属 病毒粒子为等轴对称二十面体，直径约28nm。二分体基因组，由RNA1和RNA2组成。RNA的 4 GB/T 36781—2018 5端连接VPg，3端为Poly（A），两端各有1段非编码区。RNA1长5.9kb～7.2kb，RNA2长3.5kb～ 4.5kb。 A.2.4麝香石竹斑驳病毒属 病毒粒子为等轴对称二十面体，直径约32nm～35nm。单分体基因组，RNA的3端无Poly（A）， 5端可能有一个甲基化的核苷酸帽子结构。 A.2.5黄瓜花叶病毒属 病毒粒子为等轴对称的二十面体，直径约29nm。三分体基因组，每个病毒粒子包裹有单分子的 RNA1或RNA2，或者包裹RNA3和RNA4。每个RNA片段的5端为甲基化帽子结构，所有RNA片 段的3端有一个约200nt的同源区，3端无Poly（A），但为tRNA状结构。 A.2.6南方菜豆花叶病毒属 病毒粒子为等轴对称二十面体，直径约30nm。基因组为1条正义ssRNA。 A.3症状 A.3.1黄瓜绿斑驳花叶病毒 黄瓜：叶片斑驳并凸起，畸形，植株矮化，果实上可产生黄或银色条斑，果实严重受损 西瓜：受侵染叶片轻型叶斑驳，严重时出现疱斑，植株矮化，成熟期果实表面出现浓绿色圆斑，果肉 变色和腐烂。 甜瓜：茎端新叶出现黄斑，随叶片老化症状减轻 抓子：叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈绿带状 A.3.2黄瓜花叶病毒 苗期染病子叶变黄枯萎，幼叶呈深绿与淡绿相间的花叶状，同时发病叶片出现不同程度的皱缩、畸 形。成株染病新叶呈黄绿相间的花叶状，病叶小且皱缩，叶片变厚，严重时叶片反卷；茎部节间缩短，茎 畸形，严重时病株叶片枯萎；瓜条呈现深绿及浅绿相间的花色，表面凹凸不平，瓜条畸形。 A.3.3甜瓜坏死斑病毒 被感染的子叶上出现坏死斑，3～5天后扩展至2mm～3mm。随着植株的生长，叶片上出现系统 性坏死斑点，发病严重时斑点部位坏死。 A.3.4南瓜花叶病毒 严重的系统花叶，叶片和果实畸形；系统明脉、黄色镶脉和黄色斑点。 A.3.5小西葫芦黄花叶病毒 褪绿局部斑，系统明脉，黄化，花叶，叶片畸形，矮化。 5