ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 36789—2018 动物狂犬病病毒核酸检测方法 Nucleic acid detection of animal rabies virus 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36789—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：军事医学科学院军事兽医研究所。 本标准主要起草人：冯烨、郭焕成、许运斌、江禹、涂长春 GB/T36789—2018 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及4.4与套式RT-PCR检测方法相关的专 利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人姓名：江禹、涂长春 地址：吉林省长春市净月经济开发区柳莺西路666号军事医学科学院军事兽医研究所 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 GB/T36789—2018 动物狂犬病病毒核酸检测方法 1范围 本标准规定了检测动物狂犬病病毒核酸的套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法 本标准适用于临床疑似狂犬病病毒感染动物脑组织、脊髓、脑脊液、睡液腺、唾液以及狂犬病病毒细 胞培养物中病毒核酸的检测（参见附录A）。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（Reverse-TranscriptionPolymeraseChainReaction) DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) RNA：核糖核酸(Ribonucleic Acid) DEPC：焦炭酸乙二酯（Diethypyocarbonate) PBS：磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution) Ct值：达到阈值的循环数（CycleThreshold) EDTA乙二胺四乙酸(EthyleneDiaminetetraacetic Acid) dNTP：三磷酸脱氧核糖核苷（Deoxy-RibonucleosideTriphosphate） Taq酶：耐热DNA聚合酶（ThermusAquaticusPolymerase) 3 器材和试剂 3.1器材 3.1.1仪器 II级生物安全柜、4℃离心机、冰箱（一20℃）、冰柜（4℃）、分析天平、PCR扩增仪、荧光定量PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、微波炉、震荡混匀器、组织研磨器、单道可调 移液器（10μL、200μL、1000μL）。 3.1.2耗材 手术剪、医用镊子、称量纸、棉签、琼脂糖、量筒（500mL）、锥形瓶（500mL）、一次性无RNase枪头 （10μL，200μL，1000μL）、无RNase离心管（1.5mL）、与荧光定量PCR扩增仪配套的PCR管 （0.2mL）、组织研磨棒 3.2试剂 3.2.1总RNA提取试剂。 3.2.2磷酸盐缓冲液（1mol/LPBS，pH7.4）。配制方法见附录B。 3.2.3TAE电泳缓冲液。配制方法见附录B。 3.2.4其他试剂:200IU/uL反转录酶、10X反转录酶缓冲液、40U/μLRNA酶抑制剂、5IUTaq酶、 1 GB/T36789—2018 10×Taq缓冲液（含Mg²+）、2.5mmol/LdNTPs、50μmol/L寡聚脱氧胸苷酸引物[Oligo（dT）iPrim er)、50μmol/L随机引物、25mmol/L氯化镁（MgCl）、10%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、核 酸染料、上样缓冲液、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇、双蒸水、DEPC水。 3.2.5引物及探针序列，见附录C。 4方法 4.1样品的采集、保存和运送 4.1.1对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物，应在死亡后尽早无菌采集脑组织，放人灭菌容器内；对待 活检动物，采集脑脊液和唾液拭子。生物安全要求见附录D。 4.1.2将待检样品置于2℃～8℃的运输箱内运输；如不能立即运输，可置于样品保存管内，一20℃以 下保存，保存期间避免反复冻融。样品置于一70℃以下可长期保存。 4.1.3新鲜冷藏或冰冻样品均应尽快运送至检测地点。 4.2样品处理 4.2.1 脑组织、脊髓和睡液腺 称取0.1g待检动物脑组织、脊髓或唾液腺样品，置于离心管中。加入400μL1×PBS充分研磨。 脑组织研磨液经4℃3000r/min离心10min。取100μL上清放到1.5mL离心管中，待检。 4.2.2睡液拭子样品 将唾液拭子棉签倒置于离心管中，4℃3000r/min离心10min。取上清200μL，置1.5mL离心管 中,待检。 4.2.3脑脊液或细胞培养物样品 取脑脊液样品或细胞培养物200uL，置1.5mL离心管中，待检 4.3核酸提取 4.3.2取100μL脑组织、脊髓或睡唾液腺样品悬液上清加人900μL裂解液，或200μL脑脊液、唾液样 品、细胞培养物加人800μL裂解液，剧烈振荡30s，静置5min。 4.3.4转移4.3.3中的600μL上清液至新离心管，加等体积的异丙醇，混匀后4℃静置10min，4℃ 10 000r/min离心10min。 4.3.5弃上清液，沉淀中加1mL75%乙醇，4℃12000r/min离心10min，弃上清，留沉淀，将离心管 倒置于吸水纸上干燥。 4.3.6将离心管中RNA沉淀用10μLDEPC水充分溶解。 4.4 套式RT-PCR检测方法 4.4.1对照设立 设置要求：从样品处置开始应设置阳性对照、阴性对照。 阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可以将适量灭活的狂犬病病毒添加到已知阴 2 GB/T 36789—2018 性样品中作为阳性对照。 阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。 采用4.3的方法提取阳性对照和阳性对照的RNA。 4.4.2 反转录 反应体系：以Oligo（dT)15Primer、随机引物为引物，建立20μL反转录体系。 2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL 随机引物（50umol/L) 1.5 μL Oligo(dT)15 Primer(50 μmol/L) 0.5 μL 10×反转录缓冲液 4.0 μL 反转录酶 1.0 μL RNA酶抑制剂 1.0 μL RNA 8.0 μL 反应条件：42℃孵育1.5h后，95℃反应5min，产物为cDNA。 4.4.3外套PCR反应体系 反应体系： 双蒸水 39.7 μL 10×Taq缓冲液（含Mg²+） 5.0 μL 外套上游引物 1.0 μL 外套下游引物 1.0 μL dNTPs 1.0 μL Taq 酶(5 U/μL) 0.3 μL 4.4.2的反应产物cDNA 2.0 μL 反应条件：94℃，2min后；94℃30s56℃30s→72℃40s进行35个循环；72℃10min；产物 保存于4℃产物为外套PCR反应产物。 4.4.4内套PCR反应体系 PCR反应体系，组成如下： 双蒸水 39.7 μL 10XTaq缓冲液（含Mg2+） 5.0 μL 内套上游引物 1.0 μL 内套下游引物 1.0 μl, dNTPs 1.0 μL Taq 酶(5 U/μL) 0.3 μL 外套反应产物 2.0 μL 反应条件：94℃，2min后；94℃30s-56℃30s-72℃40s进行35个循环；72℃10min；产物 为外套PCR反应产物，保存于4℃。 4.4.5电泳 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液和1%琼脂糖凝胶（见附录B）。将琼脂糖溶液倒人制胶模中， 然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3mm～5mm之间。取PCR产物与上样缓冲液混匀， 3 GB/T36789—2018 用移液枪将其加人加样孔中。接通电源，以120V电压进行电泳，20min后停止电泳。用凝胶成像仪 观察并保存结果。 4.4.6实验成立的条件 阳性对照样品的外套PCR产物出现845bp扩增带、内套PCR产物出现371bp扩增带，阴性对照 无扩增带出现（引物二聚体带除外）时，实验成立。 4.4.7结果判定 套PCR产物出现371bp特异性条带时，均判定样品为狂犬病病毒检测阳性，否则为阴性。 4.5 荧光定量RT-PCR检测方法 4.5.1对照设立 设置要求：从样品处置开始应设置阳性对照、阴性对照。 阳性对照：取已知阳性的同类样品作为阳性对照。也可以将适量灭活的狂犬病病毒添加到已知阴 性样品中作为阳性对照。 阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。 采用4.3的方法提取阳性对照和阳性对照的RNA。 4.5.2荧光定量RT-PCR反应体系建立 每个样品建立50μL荧光定量RT-PCR体系，组成如下： DEPC水 16.15 μL dNTPs 0.5 μL 10×Taq缓冲液 5μL MgCl, 12 μL 10%Triton X-100 1 μL RNA酶抑制剂 0.25 μL Taq 酶 0.5 μL 反转录酶 0.6 μL 上游引物工作液 2 μL 下游引物工作液 1 μL 探针工作液 1 μL 总RNA 10 μL 4.5.3荧光定量RT-PCR扩增 42℃30min；92℃3min；