ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T36806—2018 甘蔗杆状病毒实时荧光 PCR检测方法 Detection of Sugarcane bacilliform virus by real-time PCR 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36806—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口， 中心、农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室。 本标准主要起草人：高三基、孙生仁、吴小斌、黄美婷、傅华英、王锦达、张慧丽、陈如凯。 GB/T36806—2018 甘蔗杆状病毒实时荧光 PCR检测方法 1范围 本标准规定了甘蔗杆状IM病毒（SugarcanebacilliformIMvirus，SCBIMV）和甘蔗杆状MO病 毒（SugarcanebacilliformMOvirus，SCBMOV）实时荧光PCR检测方法的仪器与设备、试剂与材料、 样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等。 本标准适用于可能带有SCBIMV和SCBMOV病毒的活体寄主植物的快速检测，诊断， 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） Ct值：实时荧光PCR反应中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold) DNase:脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease) EDTA-Na2：乙二胺四乙酸二钠（edetatedisodium) FAM6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNase：核糖核酸酶（ribonuclease) RT/RNaseH:逆转录酶/核糖核酸酶H(reversetranscriptase/RNaseH) SCBIMV：甘蔗杆状IM病毒（SugarcanebacilliformIMvirus） SCBMOV：甘蔗杆状MO病毒（SugarcanebacilliformMOvirus) SCBV：甘蔗杆状病毒（Sugarcanebacilliformvirus） TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine） Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[Tris（hydroxymethyl）aminomethanehydrochloride] 3甘蔗杆状病毒基本信息 甘蔗杆状病毒属于花椰菜花叶病毒科（Caulimiviridae）杆状DNA病毒属（Badnavirus），英文名 称为Sugarcanebacilliformirus，缩写为SCBV。国际病毒分类委员会（ICTV）于2012年将SCBV的 2个分离物正式定为甘蔗杆状IM病毒（SugarcanebacilliformIMvirus，SCBIMV）和甘蔗杆状MO病 毒（SugarcanebaciliformMOvirus，SCBMOV）两个不同的种。甘蔗杆状病毒其他信息参见附录A。 4方法原理 在比对甘蔗杆状病毒基因组序列的基础上，设计一对仅在该病毒RT/RNaseH基因间保守的特异 性引物和一条特异性的荧光双标记TaqMan探针。在实时荧光PCR扩增反应中，TaqMan探针的荧光 信号强度伴随着目标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系，通过收集PCR扩增过程的荧光信号值，即 1 GB/T36806—2018 可判断试样是否带有目标序列。 5 仪器与设备 5.1实时荧光PCR检测仪：激发/检测波长范围350nm～750nm；可用SYBRGreenI染料和 TaqMan探针；升降温速度≥2.0℃/s；均二性十/一0.5℃：准确性十/一0.3℃；温度范围4℃~100℃。 5.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.3电子天平：感量0.01g。 5.4 高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上。 5.5微量加样器:0.1μL~2.5μL0.5μL~10μL、2μL~20μL、10μL~100μL、20μL~200μL、 50μL~1000 μL。 5.6 51.5mL、2.0mL离心管,PCR反应管、带滤芯Tip头、实时荧光PCR反应管。 5.7恒温水浴锅。 5.8鼓风干燥箱。 0802~:6 5.10生物安全柜。 5.11 采样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子。 6 试剂与材料 6.1试剂 除非另有规定外，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标。 6.1.1无菌水。 6.1.2无水乙醇。 6.1.3异丙醇。 6.1.4β-巯基乙醇。 6.1.5 70%乙醇。 6.1.6 RNase酶(10 mg/mL)。 6.1.7 三氯甲烷-异戊醇（24：1）。 6.1.8 苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）。 6.1.93mol/L醋酸钠(NaAc,pH5.2)。 6.1.10 2XCTAB抽提缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH5.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/L 氯化钠，2%CTAB，使用前加人0.1%（体积分数）的β-巯基乙醇。 6.1.11用于检测SCBIMV病毒种引物 5'-引I物(IM-QF):5-ACAAAAGGCTGAATGACAACACA-3; 3'-引物(IM-QR):5'-TTGCTACATTTTTCAGTAATGCATTG-3'。 扩增片段大小：79bp。 6.1.12 2用于检测SCBMOV病毒种引物 5'-引物(MOR-QF):5'-CAGCTCATTGTATGCTGAAAATGC-3'; 3'-引物(MOR-QR):5'-GTTTGATTTGAAGAGCGGGTTT-3'。 扩增片段大小：85bp。 6.1.13 3用于检测SCBIMV病毒种TaqMan探针 2 GB/T36806—2018 IM-QP:5-FAM-CCTGATCAGTACTCACTGCCCGGGA-TAMRA-3 6.1.14用于检测SCBMOV病毒种TaqMan探针 MOR-QP:5'-FAM-TGGAATACTTTCTTCATCCATGGCGACTTG-TAMRA-3'。 6.1.15荧光PCR反应混合液 包括2X荧光PCR反应液（含TaqDNA聚合酶）、5'-引物、3-引物、TaqMan探针等，具体配制方 法见附录B。 6.2材料 6.2.1阳性对照：用已知含甘蔗杆状病毒的甘蔗样品作阳性对照。 6.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗杆状病毒的甘蔗样品作阴性对照。 6.2.3空白对照：用无菌一级水代替样品。 7样品的采集与前处理 7.1取样工具准备 砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子等取样工具应经121℃土2℃、1.1X105Pa高压灭菌15min或经 160℃干热灭菌2h。 7.2采样方法 7.2.1采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，每采一个样品后， 采样工具用75%乙醇进行消毒。 7.2.2叶片样品：用剪刀取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶（一1叶）叶片，编号备用 7.2.3蔗汁样品：用带槽钻子钻取甘蔗植株上部蔗茎蔗汁1mL于1.5mL离心管，若为甘蔗蔗种，取中 部种茎，编号备用。 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，要求放置一80℃冰箱， 验室。 8检测 8.1蔗叶总DNA的提取 8.1.1蔗叶总DNA的提取应在样品处理区进行。取1.5mL无DNase酶的离心管，并对每个管进行 编号。 8.1.2称取0.1g~0.2g蔗叶样品材料，并用液氮研磨成粉末状（要保持液氮不挥发干净）。 8.1.3向1.5mL离心管中加人粉末，等液氮刚挥发完立即加入600μL预热（约65℃）的CTAB缓冲 液，充分摇匀。 8.1.465℃保温60min，每隔15min~20min摇匀1次。 8.1.512000g离心10min，弃沉淀，取上清液移至新离心管，加人等体积苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25： 24：1），剧烈振荡30s。 8.1.612000g离心10min，弃沉淀，取上清液移至新离心管，加人等体积三氯甲烷-异戊醇（24：1）， 3 GB/T36806—2018 剧烈振荡30S。 8.1.712000g离心10min，弃沉淀，取上清液移至新离心管。随后先加1/10体积预冷（4℃）的 置 20 min~30 min。 8.1.812000g离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤2次，每次12000g离心1min，最后用 无水乙醇洗涤1次，并12000g离心1min。离心管内壁晾干（或用灭菌过的滤纸吸干）后，加50μL无 菌水溶解。 8.1.9加人1μL10mg/mL的RNase酶，37℃水浴1h去除RNA，置一20℃保存备用。 8.1.10使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。 DNA浓度按式（1)计算： C=A260XNX50/1000 ...(1) 式中： -DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A260————260nm处的吸光值； N—DNA稀释倍数。 当A260/A28o比值在1.8~2.0之间时，适合于实时荧光PCR扩增。 8.2蔗汁总DNA提取 8.2.1取1.5mL、2