ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36820—2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶 链式反应（RT-PCR）检测方法 Detection method of Sugarcane streak mosaic virus by real-time reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36820—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口， 中心、农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室。 本标准主要起草人：高三基、黄美婷、傅华英、孙生仁、张慧丽、王锦达、陈如凯。 GB/T36820—2018 甘蔗条纹花叶病毒实时荧光反转录聚合酶 链式反应（RT-PCR）检测方法 1范围 本标准规定了甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcanestreakmosaicirus）实时荧光反转录聚合酶链式反 应（RT-PCR）检测方法的仪器与设备、试剂与材料、样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等 本标准适用于可能带有甘熊条纹花叶病毒的活体寄主植物的快速检测、诊断。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CP：外壳蛋白（coatprotein） Ct值：实时荧光PCR反应中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold) cDNA：与RNA链互补的单链DNA(complementaryDNA) ExTaqHS酶：热启动DNA聚合酶（hotstartDNApolymerase) FAM:6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechain reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction） SCSMV：甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcanestreakmosaicvirus） TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine） Tip:吸头 3方法原理 根据甘蔗条纹花叶病毒CP基因序列设计一对仅在该病毒CP基因间保守的特异性引物和一条特 异性的荧光双标记水解型寡核苷酸探针（TaqMan探针）。首先利用反转录酶将病毒RNA反转成 cDNA，再以cDNA为模板在同一反应管内连续进行实时荧光PCR扩增反应，水解型寡核苷酸探针 （TaqMan探针）的荧光信号强度伴随着自标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系，通过收集PCR扩 增过程的荧光信号值，即可判断试样是否带有目标序列。甘蔗条纹花叶病信息参见附录A。 4. 仪器与设备 4.1实时荧光PCR检测仪：激发/检测波长范围350nm750nm；可用荧光染料（SYBRGreenI)和水 解型寡核苷酸探针（TaqMan探针）；升降温速度≥2.0℃/s；均一性+/一0.5℃；准确性+/一0.3℃；温 度范围4℃~100℃。 4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 4.3电子天平：感量0.01g。 1 GB/T36820—2018 4.4高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上。 4.5 5微量加样器：0.1μL~2.5μL、0.5μL~10μL、2μL~20μL、10μL~100μL、20μL~200μL、 50 μL~1 000 μL。 4.6无核酸酶（Nuclease)的1.5mL、2.0mL离心管，PCR反应管、带滤芯Tip头、实时荧光PCR反 应管。 4.7恒温水浴锅。 4.8鼓风干燥箱。 4.9冰箱:2℃~8℃、-20℃、-80℃。 4.10生物安全柜。 4.11 采样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子。 5试剂与材料 5.1试剂 除非另有规定外，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标。 5.1.1氯仿。 5.1.2异丙醇。 5.1.3无水乙醇。 5.1.4 无核酸酶（Nuclease)水。 5.1.5 裂解液：主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，为RNA提取试剂 5.1.6 75%乙醇。 5.1.7定量荧光PCR检测引物 3'-引物:5'-GTCGATTTCTGCTGGTGAGA-3'。 扩增片段大小为130bp。 5.1.8水解型寡核苷酸探针（TaqMan探针） 5'-FAM-TGCTGCATTGATTTCGTGATGGTG-TAMRA-3' 5.1.9用于一步法的荧光反转录聚合酶链式反应混合液 包括一步法反转录聚合酶链式反应缓冲液、5'-引物、3-引物、水解型寡核苷酸探针（TaqMan探 针）、逆转录酶混合液、EαTaqHSDNA聚合酶等，具体配制方法见附录B。 5.2材料 5.2.1阳性对照：用已知含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阳性对照。 5.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗样品作阴性对照。 5.2.3空白对照：用无核酸酶的无菌一级水代替样品。 6 样品的采集与前处理 6.1取样工具准备 砍刀、剪刀、镊子等取样工具应经121℃土2℃、1.1×105Pa高压灭菌15min或经160℃干热灭菌 2 h。 2 GB/T36820—2018 6.2采样方法 6.2.1采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，每采一个样品后， 采样工具用75%乙醇进行消毒。 6.2.2叶片样品：用剪刀取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶（一1叶）叶片，编号备用 6.2.3燕茎样品：用带槽钻子钻取甘煎植株上部蔗茎蔗汁1mL于1.5mL离心管，若为甘蔗蔗种，取中 部种茎，编号备用。 6.3存放与运送 但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，或用液氮处理，尽快运送到实 验室。 7检测 7.1RNA提取 7.1.1RNA提取应在样品处理区进行。取1.5mL无核酸酶（Nuclease)离心管，并对每个管进行编号 7.1.2称取0.1g~0.2g样品材料，并用液氮研磨成粉末状（要保持液氮不挥发干净）。 7.1.3向1.5mL离心管中加人粉末，等液氮刚挥发完立即加入1mL裂解液，充分混匀，室温下静置 10 min。 7.1.4加人0.2mL氯仿，盖住管盖，剧烈振荡混匀约15s，室温静置5min后，于4℃，12000g离心 10 min。 7.1.5取上清液转人另一新的1.5mL离心管，加人等体积异丙醇，室温静置10min，于4℃，12000g 离心10 min。 7.1.6弃上清液，加入1mL75%乙醇洗涤，于4℃，12000g离心10min，重复该步骤洗涤两次 10 min。 7.1.8加入50μL无核酸酶的水溶解，提取的RNA应在2h内进行检测；若需长期保存，应放置 一80℃冰箱备用。 7.1.9使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，并估算 提取的RNA浓度。RNA浓度按式（1）计算： C=A260XNX40/1000 .(1) 式中： c—RNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）； A260——260nm处的吸光值； NRNA稀释倍数。 当A260/A28比值在为1.8～2.0之间时，适合于实时荧光反转录聚合酶链式反应扩增。 7.2实时荧光反转录聚合酶链式反应 式反应反应液，在冰上融化后，2000g离心5s。每个测试样本反应体系见附录B。 7.2.2根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，全部加完后，充分混合均匀，向每个实时荧光PCR 管中各分装18.0uL。 3 GB/T36820—2018 7.2.3在各设定的实时荧光PCR管中分别加入待测的RNA样品2.0μL（RNA约100ng），盖紧管盖 后，500g离心30s。 7.2.4将7.2.3中加样后的实时荧光PCR反应管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。实时荧 光PCR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为：第一阶段为RNA样品反转录反应：42℃ 5min反转录，95℃10s终止反转录；第二阶段为PCR反应：95℃10s，60℃34s，40个循环。在每次 循环的退火时收集荧光。 8结果判断与表述 8.1结果分析条件设定 实时荧光PCR反应结束后，设置荧光信号阈值，阈值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值 线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准。 8.2对照结果 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。采用感染了甘蔗条纹花叶病毒的甘蔗叶片总 RNA作为阳性样品；采用无甘蔗条纹花叶病毒感染的甘蔗叶片总RNA为阴性对照；用等体积的无核 酸酶的无菌一级水代替模板RNA作空白对照 空白对照，无Ct值且无扩增曲线；阴性对照，无Ct值且无扩增曲线；阳性对照，Ct值应小于或等于 30.0.并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效，需要查明原因重新检测。 8.3检测结果的判定 8.3.1阴性 Ct值大于或等于40.0，且无典型的扩增曲线，表示样品中不含甘蔗条纹花叶病毒 8.3.2阳性 8.3.3有效原则 Ct值大于35.0且小于40.0，并出现典型的扩增曲线的样本应进行重做检测实验。重复实验的结 果Ct值仍然大于35.0且小于40.0，并出现典型的扩增曲线，则判定样本检测结果为阳性；Ct值大于或 等于