ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36825—2018 蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法 Detection and identification of Eobania vermiculata (Muller,1774) 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36825—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 局、中华人民共和国张家港出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王沛、周卫川、崔俊霞、陆军、肖琼。 GB/T368252018 蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了蠕虫尹氏蜗牛Eobaniavermiculata（Muller，1774）检疫鉴定的方法原理、器具与试 剂、现场检疫、实验室鉴定、结果评定以及标本处理和保存。 本标准适用于蠕虫尹氏蜗牛的检疫鉴定 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注文件的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T3067—2011软体动物常规检疫规范 3 术语和定义 SN/T3067一2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 矢囊dartsack 蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构。 3.2 恋矢 lovedart 矢囊中钙质或壳质的骨针。 注：为蜗牛交配的刺激器官。 3.3 盲管diverticulum 受精囊柄分枝形成的空管状结构 3.4 鞭状体 flagellum 蜗牛雄性生殖系统中的附器，由阴茎本体末端延伸形成。 注：位于阴茎本体和输精管交接处后面的部分 4 方法原理 蠕虫尹氏蜗牛主要随运输工具、种苗和污染的货物远距离传播。该蜗牛为杂食性的有害生物，不需 要特定的寄主植物，凡接触过地面的物品都有可能是污染源。传播方式和传播途径是确定现场检疫的 依据。贝壳、螺体、生殖系统形态特征和线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列是实验室鉴定 的主要依据。蠕虫尹氏蜗牛相关信息参见附录A。 1 GB/T36825—2018 5 器具与试剂 5.1 器具 5.1.1 体视显微镜：10×以上。 5.1.2 放大镜。 5.1.3 手电筒。 5.1.4 塑料自封袋：5*、8#。 5.1.5广口标本瓶：500mL。 5.1.6 孔径土壤筛：4mm。 5.1.7 小铁铲。 5.1.8 游标卡尺。 5.1.9 白瓷盘。 5.1.10 培养皿。 5.1.11 镊子。 5.1.12 剪刀。 5.1.13 显微镊子。 5.1.14 显微剪刀。 5.1.15 微针。 5.1.16 解剖蜡盘。 5.1.17 标签。 5.1.18 移液枪：2.5μL，10μL，20μL,100μL，200μL，1000μL。 5.1.19 微型离心机。 5.1.20 PCR仪。 5.1.21 离心管：1.5mL。 5.1.22 PCR反应管:0.2mL。 5.1.23 恒温金属浴。 5.2 2试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 5.2.1 75%乙醇。 5.2.2无水乙醇。 5.2.3硫酸镁。 5.2.4动物基因组DNA提取试剂盒 5.2.5 2X PCR预混合液(2X Taq PCR MasterMix)。 5.2.6 双蒸水。 6 现场检疫 对来自疫区的集装箱、木质包装材料必须重点检查，仔细观察集装箱的底部和四角部位以及所装货 物与木质包装材料是否有蜗牛。对来自疫区的原木、盆景、苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应 认真检查，对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查。蜗牛爬行过后，一般都会留下银灰色 的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。发现蜗牛，随时装入塑料自封袋或标本瓶带 2 GB/T368252018 回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时，需过筛检查是否有卵或 幼螺。 7 实验室鉴定 7.1测量观察 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒长和宽。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵 和螺的形态特征。 7.2尹氏蜗牛属EobaniaHesse，1915鉴定特征 贝壳大型，圆球形，螺旋部低矮。受精囊具有延伸的盲管，其长度超过受精囊柄。矢囊很小。鞭状 体一般比阴茎和阴茎本体短。本属贝壳形态与耳螺属OtalaSchumacher，1817相似，但前者壳口简 单、口缘白色或接近棕色，外唇反折锋利；而后者壳口有时有齿、口缘内侧深褐色，外唇反折、增厚、不 锋利。 7.3蠕虫尹氏蜗牛鉴定特征 7.3.1卵 白色，椭圆形，长短径约为3mm×4.1mm。 7.3.2贝壳 7.3.2.1成螺 贝壳呈低矮圆球形，相当坚固，有4个～5个螺层，各螺层适度膨胀。体螺层圆形，在前方强烈向下 倾斜。壳面颜色多变，从黄白色到褐色，常有色带或斑点，呈蠕虫状，一般有4条～5条深褐色条带，螺 旋部色带常断裂成为一系列的斑点。体螺层腹面在色带和脐孔之间的区域为淡白色。壳口和口缘白 色，口缘外折反卷。胚螺层光滑。次螺层有许多发达的锻锤状的雕刻。贝壳无脐孔。壳高14mm～ 24mm，壳宽22mm～32mm。贝壳大小有地理分布上的差异，如在希腊的Gdvdos岛，壳高可达 24.5 mm~33.5 mm (参见附录B中图 B.1)。 7.3.2.2幼螺 幼螺贝壳外形与成螺基本相似，但口缘不外折，脐孔狭窄且开放，生长螺脐孔部分被轴唇外折所遮 盖，至成螺时脐孔完全闭合。 7.3.3螺体 浅褐色，腹足背部颜色较深，至腹部逐渐变为淡黄色（参见附录B中图B.2）。 7.3.4生殖系统 7.3.4.13 生殖系统解剖 将麻醉或闷杀（见9.1)处理后的标本，剥去外壳，将软体固定在蜡盘上，在体视显微镜下，从头部的 体右侧找到生殖孔。解部从生殖孔开始，先用显微剪刀沿生殖孔外围一圈剪开体壁，然后从背部纵向轻 轻剪开体壁肌肉。仔细辨认外生殖器的各种结构，尤其要注意阴茎牵引肌和输精管及受精囊的辨认。 最后将生殖系统从体腔中分离出来。 3 GB/T36825—2018 图、特征观察和描述。 7.3.4.2生殖系统特征 阴茎本体细长，其宽度与鞭状体差不多。阴茎肿胀，呈梭形至棒状。鞭状体也很长，末端逐渐变细。 输精管长。阴道长度适中。失囊不大，棍棒状。恋矢横切面成“十”字状四瓣分裂。游离输卵管扭曲，缠 绕。黏液腺从矢囊基部的上方插入阴道，非常发达，黏液腺2枝，每枝分两个树权，基部长，棒状，每个树 权还继续各分两枝，末端有许多分叉，呈爪状。受精囊柄长，具有相当长而稍微膨胀的颈部和强烈弯曲 的盲管（参见附录B中图B.3）。 7.3.5COI基因片段序列鉴定 参见附录C方法提取DNA、PCR扩增和测序，将所测序列与序列数据库（Genbank）登录号为 KJ995731已知蠕虫尹氏蜗牛的COI基因标准序列进行比对，相似度大于或等于95%确定为蠕虫尹氏 蜗牛的疑似样品。 8结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据，螺体和生殖器解剖形态为辅助鉴定特征，并注意与近似种鉴别（参见 附录D），符合7.3.2或同时符合7.3.2、7.3.3、7.3.4形态特征的蜗牛鉴定为蠕虫尹氏蜗牛。单独查获的 卵粒符合7.3.1形态特征，需按照SN/T3067一2011，8.4饲养鉴定方法进行孵化和饲养实验。符合 7.3.5作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证，当检测样品的DNA序列与已知蠕虫尹氏蜗牛的 DNA序列同源性大于或等于95%时，确定为蠕虫尹氏蜗牛的疑似样品，需要进一步做形态鉴定。 9标本处理和保存 9.1标本处理 将蜗牛置于盛满水的瓶中，盖上瓶盖，进行闷杀，蜗牛在慢慢室息的死亡过程中，逐渐伸展身体；或 逐渐加入少量硫酸镁，进行麻醉闷杀。 将闷杀后软体伸展的蜗牛标本置于75%的乙醇溶液中固定，每隔1d～2d换1次乙醇溶液，共换 3次～4次，便可长期保存于75%的乙醇溶液中。 9.2 标本保存 经处理后的标本，至少妥善保存6个月，并注明时间、产地、寄主、采集人等信息。 SAC 4 GB/T36825—2018 附录A （资料性附录） 螨虫尹氏蜗牛相关信息 A.1名称 学名：Eobaniavermiculata(Miller,1774) 异名：Helir vermiculataMuller，1774 英文名：Chocolate-bandsnail A.2寄主 杂食性，以各种绿色植物为食。幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食；成螺取食各种绿色植物的 茎、叶和果实，喜食多汁的蔬菜、水果和花卉等园艺作物。 A.3分类地位 蠕虫尹氏蜗牛隶属软体动物门Mollusca，腹足纲Gastropoda，肺螺亚纲Pulmonata，柄眼目 Stylommatopgora，大蜗牛科Helicidae，尹氏蜗牛属EobaniaHesse，1913。该属为大蜗牛科一小属，仅 有3个种。蠕虫尹氏蜗牛的近似种有康氏坦丁尹氏蜗牛E.constantinae（Forbes，1838）、梅西拉尹氏 蜗牛E.massylaea（Morelet，1851)。 A.4地理分布 大洋州：澳大利亚东南部。 亚洲：日本。 非洲：地中海沿岸国家。 欧洲：地中海盆地：从西班牙东部至克里米亚均有分布，具体分布包括以色列、埃及、西班牙东部、保 加利亚东部、希腊南部和北部、乌克兰、克里米亚。英国伦敦也有分布 北美洲：美国南