ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36849—2018 五彩苏类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Coleus blumei viroids 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36849—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国农业科 学院植物保护研究所、青岛市农业科学研究院。 本标准主要起草人：张永江、向均、廖富荣、辛言言、李世访、马荣群。 GB/T36849-—2018 五彩苏类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了五彩苏类病毒的检疫鉴定方法 本标准适用于可能带有五彩苏类病毒的五彩苏的检疫鉴定。 2基本信息 2 中文名称：五彩苏类病毒 学名：Coleusblumeiviroid 缩写:CbVd 异名：锦紫苏类病毒 分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae）锦紫苏类病毒属（Coleviroid）。 五彩苏类病毒的其他信息参见附录A。 3 方法原理 根据CbVd基因组RNA自然状态和变性后的不同结构分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差 异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（return-polyacrylamidegelelectrophoresis，R-PAGE）检测；根据 其核酸序列的特异性进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），通过电泳条带大小进行结果判定 仪器设备、用具及试剂 4 仪器设备 4.1 电子分析天平（0.001g）、垂直电泳槽、小型离心机、台式冷冻离心机、普通PCR仪、电泳系统 pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微 波炉等。 4.2用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）、吸头、离心管（0.2mL、0.5mL、1.5mL)及研 钵等。 4.3试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。 R-PAGE试剂见附录B;RT-PCR试剂见附录C。 5 检测方法 5.1 R-PAGE检测 R-PAGE检测见附录B。 1 GB/T36849—2018 5.2 RT-PCR检测 RT-PCR检测见附录C。 6 结果判定 样品经5.1和5.2两种方法检测为阳性，即可判定样品带有CbVd；若RT-PCR结果为阳性，其产物 测序比对也为阳性，可判定样品带有CbVd。 7 样品保存与结果记录 7.1 样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存，并作好登记和标记，以备复核用。种子样品可保存在室温干燥 环境中；叶片样品保存在一80℃冰箱中。 7.2 结果记录 完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员 的签字等；R-PAGE测定需有银染色结果图片，RT-PCR检测需有电泳结果图片。 2 GB/T 36849—2018 附录A （资料性附录） 五彩苏类病毒相关资料 A.1寄主范围 仅限于五彩苏（Coleusblumei)。 A.2 地理分布 巴西、德国、加拿大、日本、中国、韩国、印度、印度尼西亚。 A.3 传播途径 可通过种子传播，种传率一般为16%68%；在品种“RuhmvonLuxemburg”的五彩苏上，CbVd-1 的种传率甚至可以高达100%。也可通过花粉传播 A.4病害症状 不同品种的五彩苏上可引起植株矮化、叶色斑驳等不同的症状；在某些品种的五彩苏上也可能呈潜 伏侵染。 A.5 基因组特征 五彩苏类病毒包括6种，分别为五彩苏类病毒-1～五彩苏类病毒-6（CbVd-1～CbVd-6），均为共价 闭合环状的单链RNA分子；六种五彩苏类病毒具有共同的中央保守区（central conserved region， CCR）CbVd-1~CbVd-6的大小分别为250bp，301bp，364bp，295bp，274bp，342bp，两两之间的序 列相似性（%）见表A.1。 表 A.1 六种五彩苏类病毒中央保守区序列相似性 CbVds CbVd-1 CbVd-2 CbVd-3 CbVd-4 CbVd-5 CbVd-6 CbVd-1 100% 57.95% 34.32% 56.39% 50.35% 38.3% CbVd-2 100% 64.11% 41.25% 52.13% 72.51% CbVd-3 100% 61.58% 38.19% 70.68% CbVd-4 100% 59.12% 39.89% CbVd-5 100% 59.88% CbVd-6 3 GB/T36849—2018 附录B （规范性附录） R-PAGE检测 B.1试剂与材料 B.1.11mol/L磷酸氢二钾（K2HPO4） 磷酸氢二钾（K,HPO,) 17.42 g 加双蒸水定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.22.5mol/L磷酸氢二钾（KzHPO4） 磷酸氢二钾（K,HPO.) 43.55 g 加双蒸水定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。 B.1.33mol/L乙酸钠（NaAc)(pH5.2) 40.83 g 三水乙酸钠 用3mol/L乙酸调节pH至5.2，用双蒸水定容至100mL，高压蒸汽灭菌。 B.1.44mol/L氯化锂(LiCI) 氯化锂(LiCI) 16.96 g 加双蒸水定容至100mL。用0.22um滤膜过滤除菌或高压蒸汽灭菌。贮存于4℃。 B.1.55×三羟基甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)电泳缓冲液 三羟基甲基氨基甲烷(Tris) 27 g 硼酸（HBO:） 13.75 g 乙二胺四乙酸（EDTA)(0.5mol/LpH8.0) 10 mL 加灭菌双蒸水400mL溶解，定容至500mL。 B.1.630%胶液 称取丙烯酰胺（C.H,NO)29g.N,N-亚甲基双丙烯酰胺（CH1oNzOz)1g，加水定容至100mL，过 滤除菌，贮存于4℃。 B.1.710%过硫酸铵溶液（现用现配） 称取0.1g过硫酸铵[（NH）2S,O]，加水定容至1mL。 B.1.8四甲基乙二胺（TEMED) B.1.9固定液 量取无水乙醇（C,H，OH)30mL及冰乙酸（C,HOz）3mL，加水定容至300mL。 B.1.10 染色液 称取硝酸银（AgNOg）0.6g，加水溶解，定容至300mL。 4 GB/T36849—2018 B.1.11显色液（现配现用） 在300mL水中，加入氢氧化钠（NaOH)3g及甲醛（HCHO）1mL，混合均匀。 B.1.12终止液 称取碳酸钠（Na2CO）3.7g，加水溶解，定容至300mL。 注：电泳中用到的丙烯酰胺（C,H,NO)是神经毒剂，避免接触皮肤，操作时要带手套。 B.2实验步骤 B.2.1样品RNA的提取 取1g植物组织样品放于研钵中，加入液氮冷冻后充分研碎再转人离心管，然后加人2mL KHPO,（1mol/L）和适量统基乙醇（约8uL），再加入2mL水饱和酚/三氯甲烷（体积比为1：1）充分 混匀，4℃，10000r/min离心10min。取上层液体，加入同体积的水饱和酚/三氯甲烷（体积比为1：1） 充分混匀，4℃，10000r/min离心10min。取上层液体，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀， 一20℃存放至少2h，4℃，10000r/min离心10min。取固体沉淀，加人1mL的双蒸水充分溶解后， 加人等体积的K，HPO.（2.5mol/L）和等体积的乙二醇单甲醚，充分混匀，4℃，10000r/min离心 10min。取上层液体，加人ddH,0至10mL再加人1/100体积的2%十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB），摇匀后放人冰中存放3h～4h，4℃，10000r/min离心10min。取沉淀，加入1mL的双蒸 水充分溶解后，再加入2.5倍体积的无水乙醇、1/10体积的醋酸钠（3mol/L），摇勾后一20℃存放至少 2h，4℃，10000r/min离心10min。取沉淀，400μLddH20溶解后加人400μLLiCl(4mol/L)，混匀 后置于冰上至少4h，10000r/min离心10min。取上层液体，吸至1.5mL离心管，加入2.5倍体积的 无水乙醇，一20℃存放至少2h，10000r/min离心10min。取沉淀，然后用70%乙醇洗沉淀，干燥后溶 于 30 μL ddH,0中。 B.2.2电泳 B.2.2.1凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶浓度为5%。在小烧杯中按顺序加人18.77mL双蒸水，5mL30%凝胶储备液， 6mL5×TBE缓冲液，20μLTEMED，210μL10%过硫酸铵（现配现用），充分混匀后灌胶。然后插入 样品梳。待胶完全凝聚后在电泳槽内加入1×TBE电级缓冲液，然后轻轻拔掉梳子。 B.2.2.2第一向电泳 室温下进行，电泳缓冲液为1×TBE，电泳方向从负极到正极，恒压200V。上样量为6μL～ 10μL。当二甲苯睛示踪染料迁移到离凝胶底部3cm~4cm处停止电泳。 B.2.2.3第二向电泳 将正向电泳缓冲液倒出，然后把电泳槽放到70℃～80℃的烘箱中预加热，样品变性30min。同时 将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到80℃。倒人电泳槽中，变换电极进行反向电泳。当二甲苯睛示 踪染料迁移到凝胶板顶部时，停止电泳，进行凝胶染色。 B.2.3染色 B.2.3