ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36831—2018 松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Cronartium fusiforme Hedgcock & Hunt ex Cummins 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36831—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：王颖、程颖慧、叶奕优、余道坚、高瑞芳、章桂明、李芳荣、史亚千、李秋枫、刘新娇、 封立平、陈吴健。 GB/T 36831—2018 松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了松纺锤瘤锈病菌（CronartiumfusiformeHedgcock&HuntexCummins）的检疫鉴 定方法 本标准适用于松纺锤瘤锈病菌寄主、转主寄主及其产品中携带松纺锤瘤锈病菌的检疫鉴定 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 性孢子器 pycnia 由担孢子萌发形成的单核菌丝体在侵染寄主时形成的锈菌性器官。 2.2 性孢子 pycniospore 性孢子器中产生的单核孢子。 2.3 锈孢子器 aecia 由性孢子与受精丝结合或与单核菌丝结合产生的双核次生菌丝组织。 2.4 锈孢子aeciospore 锈孢子器中产生的串生、单胞、双核、黄色、球形或卵形的孢子。 2.5 夏孢子堆 uredinium 由双核菌丝产生的成堆的黄色或橙黄色的双核孢子。 2.6 夏孢子 urediniospore 夏孢子堆内产生的单胞、双核表面有细刺或疣刺的无性孢子。 2.7 冬孢子teliospore 由双核菌丝产生的厚壁有性孢子在生长后期形成的单胞或多胞的休眠孢子。 2.8 telia 冬孢子堆 冬孢子聚集在一起形成的组织。 2.9 担子basidia 寄主体上的冬孢子萌发形成的组织。 2.10 担孢子basidiospore 担子横裂四胞，每胞生一小柄，其上着生单胞、无色或稍带黄色的孢子。 1 GB/T36831—2018 3基本信息 中文名：松纺锤瘤锈病菌 英文名：Southernfusiformrust 学名:Cronartium fusiforme Hedgcock &. Hunt ex Cummins 无性态：PeridermiumfusiformeJ.C.Arthur&.Kern. 分类地位：真菌界Fungi，担子菌门Basidiomycota，柄锈菌亚门Puccniomycotina，柄锈菌纲Puccin iomycetes，柄锈菌目Pucciniales，柱锈菌科Cronartiaceae，柱锈属Cronartium。 传播途径：松纺锤瘤锈病菌主要通过气流及感病寄主传播 近似种：油松疱锈病菌Cronartiumcoleosporioides，北美松疱锈病菌C.comandrae，香蕨柱锈菌 C.comptoniae，苏格兰松疱锈病菌C.flaccidum。 松纺锤瘤锈病菌的其他信息参见附录A～附录C 4方法原理 松疱锈病菌的形态学特征及ITS1/ITS4核酸序列比对结果作为检疫鉴定该病菌的主要依据，同时 参考病原菌的发生国家和地区、寄主范围及为害症状 5 仪器用具和主要试剂 5.1仪器用具 高压灭菌锅、显微镜、体视显微镜、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温 水浴锅、样品袋、标签、放大镜、培养皿、载玻片、盖玻片、手术刀、手术剪、镊子、吸管、酒精灯、滤纸等。 5.2 主要试剂 三羟甲基氨基甲烷乙酸缓冲液、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙酸、乙醇、引物ITS1/ITS4、PCR缓冲 液、Taq聚合酶、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、DNA分子量Marker等分子生物学试剂及基因 组提取试剂盒。 6检疫鉴定 6.1症状检查 观察松属寄主植物： a）主干和枝条上是否有圆形、纺锤形或不规则的肿瘤，肿瘤表面皮层不规则破裂，且破裂处当年 生出新皮层，来年再破裂，皮层完全脱落后，露出浸透松脂的木质部，颜色较深，犹如灼伤： b) 肿瘤上部枝条或树干日久便枯死或风折，检查在肿瘤裂缝处是否有桔黄色蜜滴溢出，其中混有 性孢子； c) 肿瘤表皮下是否有黄色疱状孢子器，含有大量的黄色粉状锈孢子； d）受侵种苗是否出现丛枝。 2 GB/T36831—2018 较健康部分稍淡。在夏孢子堆中生出许多褐色至暗褐色的毛状物，即冬孢子柱。 松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征比较参见附录B。 将可疑样品带回实验室作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期 等信息。 6.2形态学特征 锈孢子器球形至梭形，壁薄，厚度为2个3个细胞，有疣状突起；锈孢子倒卵形至近球形，大小为 （22μm~28μm）×（13μm~18μm），具有粗糙的疣状隆起，高为1.5μm~2.5μm。夏孢子堆着生在叶 背面，半球形，偶尔有侧丝，透明至棕色；夏孢子卵形至椭圆形，微黄色，大小为（17μm～21μm）× (12μm～15μm），夏孢子表面有均匀锐利的小刺，长为0.7μm～1.5μm。冬孢子堆着生在叶背面，散 开，呈纤维状栗棕色孢子柱；冬孢子圆柱形至梭形，微黄棕色，大小为（35um～70um）×（14um～ 和附录 C。 6.3核酸序列比对 6.3.1引物 采用ITS1/ITS4进行扩增，引物序列为： ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 6.3.2DNA提取 取病原菌孢子提取DNA（参见附录D)。 6.3.3PCR反应 PCR反应体系总体积30μL，包含：缓冲液3.0μL；10mmol/LdNTP0.5μLTaq聚合酶2.5U；引 物各0.5μL（20μmol/L）;DNA摸板1μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃1min，53℃1min， 72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min SIC 单带出现，扩增产物进行序列测定。 将测序获得的序列与NCBI网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析。 7结果判定 病害症状符合6.1，而且病菌的形态学特征符合6.2,ITS序列比对结果与6.3描述相符，判定为松 纺锤瘤锈病菌。 8样品保存与处理 松纺锤瘤锈病的样品或病组织及玻片标本、核酸等需保存至少6个月，以备复验、谈判和仲裁。保 3 GB/T36831—2018 存期满后，样品经高温高压灭菌或其他适当的方式进行除害处理 实验室记录保存 妥善保存检测报告包括症状、病菌等图文资料。检测报告注明检测日期、方法、结果等，并有实验人 员和审核人员签名。 4 GB/T 36831—2018 附录A （资料性附录） 松纺锤瘤锈病菌及其近似种的地理分布和寄主范围 A.1松纺锤瘤锈病菌Cronartiumfusiforme的地理分布和寄主范围 A.1.1地理分布 美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、菲律宾、前苏联、比利时、土耳其、德国、印度、西班牙、葡萄牙、英 国、巴基斯坦、危地马拉、中国。 A.1.2寄主范围 寄主：华山松Pinusarmandii，北美短叶松P.banksiana，加勒比松P.caribaea，P.chihuahuana， P.clausa，扭叶松P.contorta，赤松P.densiflora，萌芽松P.echinata，湿地松P.elliottii，地中海松 P.halepensis,P.khasya，P.leiophylla var.chihuahuana，琉球松P.luchuensis,马尾松P.massoni- ana，欧洲山松P.mugo，海岸松P.pinaster，长叶松P.palustris，西黄松P.ponderosa，尖刺松 P.pungens，辐射松P.radiata，落叶松P.resinosa，刚松P.rigida，晚松P.serotina，欧洲赤松 P.silvestris，油松P.tabulaeformis，火炬松P.taeda，台湾二叶松P.taiwanensis，P.teocote，黑松 P.thunbergii，弗吉尼亚松P.virginiana，云南松P.yunnanensis。 转主寄主：尖锐栎Quercusacuta，麻栎Q.acutissima，海岸栎Q.agrifolia，美国白栎Q.alba， 栎Q.aliena，黄北栎Q.bicolor，Q.borealis，峡谷栎Q.chrysolepis，胭脂虫栎Q.coccifera，猩红栎 Q.coccinea，波罗栎Q.dentata，道格拉斯栎Q.douglasi，加州丛栎Q.dumosa，Q.engelmanni，白栎 Q.fabri，南美红栎Q.falcata，奥里根白栎Q.garryana，Q.glandulifera，青刚栎Q.glauca，大叶栎 Q.griffithii，冬青栎Q.iler，鹅卵石橡树Q.imbricaria，加州黑栎Q.kelloggii，桂叶栎Q.laurifo- lia，Q.lusitanica，Q.maccormickii,大果栎Q.macrocarpa，Q.marima，马利兰德栎Q.marilandic