ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 36858—2018 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法 Determination of aflatoxin B, in feeds- High performance liquid chromatography 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36858—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准主要起草人：齐德生、张妮娅、张家才、孙铝辉、王峻、陶灿、王帅。 GB/T36858—2018 饲料中黄曲霉毒素B，的测定 高效液相色谱法 警示一一黄曲霉毒素B，是高致癌物质，应小心处理，分析操作过程应在通风橱内或指定区域内进 行。分析过程中，操作者应采取相应的防护措施。分析过程结束后，接触过的器血及黄曲霉毒素B，溶 液应使用浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡过夜。 1范围 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中黄曲霉毒素B的测定。 本方法的检出限为0.5μg/kg，定量限为2.0μg/kg。 2规范性引用文件 2 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样中的黄曲霉毒素B经黄曲霉毒素B提取溶液提取后，再经三氯甲烷萃、三氟乙酸衍生，衍 生后的黄曲霉毒素B采用反相高效液相色谱-荧光检测器进行测定，外标法定量。 4试剂或材料 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 4.1水：符合GB/T6682中规定的一级用水。 4.2 甲醇：色谱级。 4.3 3乙腈：色谱级。 4.4三氯甲烷。 4.5 黄曲霉毒素B提取溶液：量取84mL乙睛，加入到16mL水中，混匀。 酸，混匀。临用现配。 4.7流动相：分别量取20ml甲醇、10mL乙睛和70mL水，混匀。经0.22μm有机滤膜过滤后备用。 4.8黄曲霉毒素B标准储备溶液（1000μg/mL)：精确称取黄曲霉毒素B对照品（纯度≥98%）10.0mg， 期为6个月。或有证标准溶液。 1 GB/T368582018 4.9 9黄曲霉毒素B标准工作溶液：取1.0mL黄曲霉毒素B，标准储备溶液，用乙睛定容至100mL，浓 度为10μg/mL。再取此稀释液1.0mL，用乙睛定容至100mL，则浓度稀释为100ng/mL的标准工作 溶液。 2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准系列溶液。临用现配。 4.11有机滤膜：直径50mm，孔径0.22μm。 4.12针头式过滤器：有机型，孔径0.22um 4.13乙腈水溶液（90+10）：量取90mL乙睛，加人到10mL水中，混匀。 5 仪器设备 5.1高效液相色谱仪：配备荧光检测器。 5.2分析天平：感量为0.01mg。 5.3溶剂过滤器：规格1000mL。 5.4氮吹仪。 5.5恒温振荡器。 5.6旋涡混合仪。 SAG 5.7超声波清洗仪。 5.8 3水浴锅。 6样品 按GB/T14699.1规定采集有代表性的试样，按照GB/T20195规定将试样粉碎，过0.42mm分析 筛，混匀后装人密闭容器中，备用。 7试验步骤 7.1试样处理 平行做两份试验。称取5.00g（精确到0.01g）试样置于100mL带塞锥形瓶中，加入25.0mL黄曲 霉毒素B提取溶液（4.5），室温下200r/min振荡提取60min，用中速滤纸过滤，取10.0mL滤液于 50mL具塞离心管中，加人10.0mL三氯甲烷（4.4)萃取，旋涡混合1min，静置分层后，取下层萃取液 于15mL具塞离心管中，50℃水浴氮气吹干。加人200μL乙水溶液（4.13）复溶，然后加入700uL 黄曲霉毒素B衍生溶液（4.6），加塞混匀，40℃下恒温水浴衍生反应75min后，经0.22um微孔滤膜过 滤后，待测。 7.2标准系列 分别取0.9mL黄曲霉毒素B标准系列溶液（4.10）于7个10mL具塞离心管中，50℃水浴氮气吹 干，用200uL乙水溶液（4.13）复溶，然后加700L黄曲霉毒素B衍生溶液（4.6），加塞混匀，40℃下 恒温水浴衍生反应75min，再经0.22μm微孔滤膜过滤后，待测。 7.3 3高效液相色谱参考条件 色谱柱：C1s色谱柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5um；或性能相当者。 2 GB/T 36858—2018 流动相（4.7）。 流速：1 mL/min。 激发波长：365nm；发射波长：440nm。 柱温：30℃。 进样体积：20μL。 7.4测定 在上述液相色谱参考条件下，将衍生后的黄曲霉毒素B标准系列溶液、试样溶液注人高效液相色 谱仪，测定相应的响应值（峰面积），采用单点或多点校正，外标法定量。黄曲霉毒素B标准溶液色谱图 参见附录A。 3试验数据处理 8 试样中黄曲霉毒素Bl的含量以质量分数w表示，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1)计算： 0.9 Xp X Vi = 0 (1) m X V2 式中： 试样衍生液在标准曲线上对应的黄曲霉毒素Bi含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V一一提取液的总体积，单位为毫升（mL）； Vz一一用于萃取的提取液体积，单位为毫升（mL）； 一试样的质量，单位为克（g）； m 0.9一一衍生后的试样溶液体积，单位为毫升（mL）。 精密度 9 在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，不大于该平均值的20%。 GB/T36858—2018 附录A （资料性附录） 黄曲霉毒素B，标准溶液高效液相色谱图 黄曲霉毒素B标准溶液高效液相色谱图见图A.1。 T.U 2 黄曲毒海素B 14.832 1. 15] 1.11 1. 05- 0. 95- F6 0 0. 85- 80 0 4 6 8 10 2 14 16 时间 /nin 图 A.1 黄曲霉毒素B，标准溶液（50ng/mL)高效液相色谱图 GB/T36858—2018 附录A （资料性附录） 黄曲霉毒素B，标准溶液高效液相色谱图 黄曲霉毒素B标准溶液高效液相色谱图见图A.1。 T.U 2 黄曲毒海素B 14.832 1. 15] 1.11 1. 05- 0. 95- F6 0 0. 85- 80 0 4 6 8 10 2 14 16 时间 /nin 图 A.1 黄曲霉毒素B，标准溶液（50ng/mL)高效液相色谱图