ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36848—2018 鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Avocado sunblotch viroid 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36848—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张永江、郑耘、张京萱、辛言言、向均、卢小雨。 GB/T368482018 鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了鳄梨日斑类病毒逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带鳄梨日斑类病毒的植物及其果实的检疫鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3基本信息 中文名：鳄梨日斑类病毒 学名：Avocado sunblotch viroid 缩写：ASBVd 分类地位：鳄梨日斑类病毒科（Ausunviroidae）鳄梨日斑类病毒属（Asunviroid） 鳄梨日斑类病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据ASBVd在寄主植物上的症状进行初步判定；根据其RNA自然状态和变性后的不同结构分子 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（Return-Polyacrylamide GelElectrophoresis，R-PAGE)检测；根据基因组特征进行RT-PCR检测，通过电泳条带大小进行结果 判定。 5仪器设备及设施、用具及试剂 5.1仪器设备及设施 天平（感量0.001g）、高速冷冻离心机、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温 室、恒温水浴、低温冰箱等。 微量移液器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、研钵、离心管（1.5mL、2.0mL）、花盆、 消毒土等。 5.2RT-PCR检测试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。具体见附录B。 1 GB/T36848—2018 5.3 往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。具体见附录C 6样品制备 6.1种子类 随机抽取100粒种子，将其分为五组，在适宜的发芽温度（20℃～28℃）下催芽，直至长出第一对真 叶。随机抽取20株苗叶片，每株取1g叶片，制备成一个样品。 6.2 苗木类 将鳄梨苗木等繁殖材料种植在隔离温室中，于25℃生长并观察症状。表现症状的叶片（或花芽）直 接取症状部位1g制备成一个样品：无症状植株则5株为一组，混合采集叶片（或花芽）1g制备成一个 样品。 7检测方法 7.1RT-PCR检测 方法见附录B。 7.2 2往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 方法见附录C。 8结果判定 如RT-PCR检测结果为阳性，往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定也为阳性，可判定待检样品带有 鳄梨日斑类病毒。如RT-PCR检测结果为阴性，则判定待检样品不带有鳄梨日斑类病毒。 9样品和档案保存 9.1样品保存 经检测确定携带鳄梨日斑类病毒的样品干燥后在一80℃冰箱保存1年。在鳄梨繁殖材料中发现 该类病毒的，采集叶片、花芽等类病毒浓度较高的材料干燥处理保存。检测原始记录、照片等文档按有 关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经手人和 实验人员的签字。RT-PCR检测需有电泳结果及测定序列；往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定需有 图片。 2 GB/T368482018 附录A （资料性附录） 鳄梨日斑类病毒生物学特性 A.1病原及其特性 ASBVd为棒状结构，是一条共价闭合的单链环状RNA分子，由247个核苷酸残基组成，分子质量 为0.8X10°u。ASBVd序列独特，富含A-U碱基，与其他类病毒的同源率低，具有自我切割的特性。 ASBVd在寄主的叶绿体内增殖和积累，滴度很高，有时与寄主5SRNA的浓度相当。 A.2寄主范围 寄主范围仅限于樟科鳄梨属植物 A,3病害症状 受ASBVd侵染的鳄梨（（PerseaamericanaMill.），树势衰弱，在果实上出现黄色、白色或粉红色的 斑纹，有时水果上能形成下陷的火山口状病斑，病斑可为黄色、绿色和深红色，受害果实市场价值降低； 还可以在茎、子叶上引起黄色、橙色或白色的下陷的斑或点；在叶片上引起褪绿和扭曲。受害植株比健 康植株稍矮，但较难区分。田间ASBVd的典型症状是枝权表皮上呈现的条纹和斑点 ASBVd侵染鳄梨后，造成严重的经济损失。病果树与健康果树相比，产果数量减少，产量下降 30%以上，树干矮小，枝干朝地面弯曲，树形呈扁平状，平伸的树形增加了暴露日光的面积，易被强阳光 灼伤。果实上的条纹影响了鳄梨的市场价值。 A.4分布地区 澳大利亚、以色列、秘鲁、南非、美国及委内瑞拉。 A.5传播方式 ASBVd可通过嫁接、种子、花粉和机械等方式传播，但至今尚无昆虫传播的报道。该类病毒可通过 嫁接方式在樟科植物之间传播，也能通过花芽、接穗、树皮等嫁接方式传播，自然的根接也能传播。潜伏 传率较低，常小于5%，被传播的后代植株也表现症状。在实验条件下，甲虫（Apismellifera）能导致低 频率（1.8%~3.3%）的花粉传播。 SAG 3 GB/T36848—2018 附录B （规范性附录） RT-PCR检测 B.1试剂 B.1.1RNA抽提 采用RNA提取试剂（Trizol)提取总RNA。 B.1.2 50XTAE 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰醋酸 52.1 mL NaEDTA· 2H,0 37.2 g 加去离子水定容至1L，用时加水稀释至1XTAE。 B.1.3 36×加样缓冲液 溴酚蓝 0.25% 蔗糖水溶液 40%（质量分数） B.2实验步骤 B.2.1 总RNA提取 B.2.1.1取样 鳄梨苗木取叶片部分，花取花芽，果实取表现症状的果皮。 B.2.1.2 RNA抽提 称取鳄梨苗木的叶片、或花芽、或果皮样品（被检测样品、阳性对照为带有鳄梨日斑类病毒的植物材 料、阴性对照为不带有鳄梨日斑类病毒的材料）0.1g，液氮充分研磨。加入1mLTrizol,混匀，倒入 1.5mL离心管中。加人0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡15s，4℃条件下12000r/min离心10min，小心 吸取上层水相至新离心管中。加人等体积异丙醇，混勾，一20℃静止10min，4℃条件下12000r/min 离心15min，弃上层水相。加入1mL75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下10000r/min离心10min，弃上 层乙醇相，干燥沉淀。加人30μL经过焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的水，置于50℃条件下5min溶解沉 淀，存于一80℃条件下备用。也可采用供应商推荐的试剂盒抽提RNA。 B.2.2 RT-PCR反应 B.2.2.1 引物 ASBVdf:5'-AGTTCACTCGTCTTCAATCTC-3" ASBVdr:5-CTGAAGAGACGAAGTGATCAA-3 4 GB/T36848—2018 产物长度：247bp。 B.2.2.2反转录 反应体系：20μL；在0.2mLPCR管中加人总RNA1μL，脱氧核糖核苷酸（dNTPs，10mmol/L) 1μL,DEPC-HO10μL，ASBVdr（20μmol/L)2uL，70℃保温5min；冰上放置5min；再加人5X反转 录缓冲液4μL,RNA酶抑制剂(RNasin40U/μl)1μL，逆转录酶（M-MLV，200U/μL)1μL，42℃保温 1h，得到cDNA后用作PCR的模板。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。 B.2.2.3PCR扩增 反应体系：20μL；在0.2mLPCR管中加人10XPCR缓冲液（含Mg+）2μL，dNTPs（10mmol/L） 0.6μL，ASBVdf及ASBVdr(均为20μmol/L)各0.5μL，Taq酶（2U/μL)1μL，模板2μL和DEPC H.O13.4uL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。 反应程序：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃30s；30个循环；72℃8min。 注：如采用商品化一步法RT-PCR检测试剂盒，可按照说明书进行操作，将步骤B.2.2.2和B.2.2.3合并进行。 B.2.3 3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 灌制2%琼脂糖凝胶板，室温凝胶30min，取5μLPCR产物与6X加样缓冲液混匀后点样，用DNA 分子标记作分子量标记，在1×TAE中以5V/cm的电压电泳30min。溴化乙锭溶液（0.5μg/mL）染色 10min,用凝胶成像仪照相。 B.2.4PCR产物测序 将电泳后有约为247bp条带的PCR产物直接送测序公司进行序列测定。 B.3结果判断 电泳图中Marker标注每条带的分子量大小。阳性对照在247bp处有扩增片段，阴性对照和空白 对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增产物，产物序列与ASBVd序列比对一致性为 95%以上的，可判定为阳性。结