ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36833—2018 马铃薯X病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Potato virus X 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36833—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、浙江大学、中华人民共和国山东出入境检验检疫局 本标准主要起草人：刘洪义、刘忠梅、车瑞丰、陈定虎、魏梅生、张星哲、李桂芬、张永江、吴建祥、 封立平、袁建江、杨立群。 GB/T36833—2018 马铃薯X病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了马铃薯X病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能带有马铃薯X病毒的马铃薯植株、繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB7331马铃薯种薯产地检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3马铃薯X病毒基本信息 中文名：马铃薯X病毒 学名：Potato virusX 缩写:PVX 分类地位：甲型线状病毒科（Alphafleriviridae），马铃薯X病毒属（Poteruirus）。 传播途径：田间自然条件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之间接触摩擦进行机械传播，在农 成。有资料表明马铃薯实生种子可传带该病毒，但在生产上意义不天；未见其他茄科作物种子传带该病 毒的资料。据报道，某些昆虫如异黑蝗（Melanoplusdifferentialis）和绿丛蠡斯（Tettigonia iridissima）的咀嚼式口器经机械作用可传播该病毒，苋丝子（Cuscutacampestris）和集合油壶菌 （Synchyrtiumendobioticum）也能传播该病毒。 马铃薯X病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 PVX的基因组特征和免疫原性是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVX的基因组特征建立反转录 PCR（RT-PCR）、实时荧光反转录PCR（Real-timeRT-PCR）和反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检 测方法；依据PVX免疫原性建立酶联免疫吸附测定（ELISA）方法、免疫层析试纸条检测方法和斑点酶 联免疫吸附测定（dot-ELISA）方法：通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有PVX。 5仪器设备、用具及试剂 5.1仪器设备 酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳系统、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、水浴锅、 pH计、凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、电子天平（0.001g）、涡旋振荡器、组织捣碎机、超 1 GB/T36833—2018 净工作台、低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、恒温培养箱、紫外分光光度计等。 5.2用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）、吸头、离心管和研钵等。 5.3试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)所需试剂见附录B,RT-PCR检测所需试剂见附录C, Real-timeRT-PCR检测所需试剂见附录D,RT-LAMP检测所需试剂见附录E，免疫层析试纸条检测 所需试剂见附录F,dot-ELISA检测所需试剂见附录G。 6样品的抽取及制备 6.1抽样 马铃薯贸易商品或科研用薯材料或国际间种质交流材料等现场抽样按照SN/T2122的规定执行， 田间调查采样按照GB7331的规定执行。 6.2马铃薯组培苗、微型薯、块茎等样品的制备 将马铃薯组培苗、微型薯、块茎播于非土介质或灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长 出3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。表现 可疑症状的繁殖材料，可直接用于检测，必要时再进行栽培生长实验。 6.3茄科等寄主植物种子样品的制备 将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出 3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。 7检疫鉴定方法 7.1DAS-ELISA检测 DAS-ELISA检测见附录B。如选用合格的试剂盒，按试剂盒说明操作。 7.2 2RT-PCR检测 RT-PCR检测见附录 C。 7.3 3Real-timeRT-PCR检测 Real-timeRT-PCR检测见附录D。 7.4RT-LAMP检测 RT-LAMP检测见附录E。 7.5 免疫层析试纸条检测 免疫层析试纸条检测见附录F。如选用不同生产商的合格产品，按其操作说明操作。 2 GB/T 36833—2018 7.6 5dot-ELISA检测 dot-ELISA检测见附录G。 8结果判定 8.1无可疑症状的样品，经PVX特异性的血清学检测（7.1、7.5、7.6任选一种）或分子检测（7.2、7.3、7.4 任选一种）后，任意一项结果为阴性时，则判定样品不带有PVX；有可疑症状的样品，经PVX特异性的 血清学检测（7.1、7.5、7.6任选一种）和分子检测（7.2、7.3、7.4任选一种）后，两项结果均为阴性时则判定 样品不带有PVX。 8.2PVX特异性的血清学检测结果（7.1、7.5、7.6任选一种）、分子检测结果（7.2、7.3、7.4任选一种）中 任意两项为阳性时，则判定样品带有PVX。 样品保存与结果记录 9 9.1林 样品保存 样品直接放于一80℃冰箱或冷冻干燥后放于一20℃或一80℃冰箱保存1年，保存的样品要做好 标记和登记工作。以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，应经灭活处理。 9.2 结果记录 的签字；酶联免疫吸附方法应有酶联反应的原始数据，dot-ELISA检测应有显色图片，免疫层析试纸条 检测应有结果图片，RT-PCR检测应有电泳结果图片，Real-timeRT-PCR检测应有扩增曲线结果图片， RT-LAMP检测应有结果图片。 3 GB/T36833—2018 附录A （资料性附录） 马铃薯X病毒背景资料 A.1寄主范围 该病毒可侵染16科240种植物，茄科植物是其主要寄主，主要危害马铃薯（Solanumtuberosum ssp.tuberosum）、烟草（Nicotianaspp.）、番茄（Lycopersiconesculentum）等。其诊断寄主有白肋烟 （Nicotianatabacumcv.Whiteburely）及其他烟草品种。初侵染的叶片通常表现为坏死斑，之后发展 为坏死斑驳、褪绿、花叶或脉褪绿。在曼陀罗（Datura stramonium）上继斑驳之后产生褪绿环、脉褪绿 或脉坏死。烟草栽培品种适于作繁殖寄主。千日红（Gomphrenaglobosa）是较好的指示植物，除HB株 系外都产生局部斑。 A.2分布 世界马铃薯栽培地区都有该病毒的发生。 A.3病害症状及危害 在田间，PVX侵染马铃薯植株，引起轻型花叶或者潜隐症状，若多年侵染则易引起重花叶或者植株 矮化，造成10%80%减产。PVX常与PVY、PVS、PSTV等病毒或类病毒复合侵染，使症状加剧。 A.4粒体特征 马铃薯X病毒是一条正链RNA组成的线形病毒，RNA长约6.4kb，病毒粒体呈线形，大小为 515 nmX13 nm。 A.5基因组特征 PVX基因组RNA的5'-末端有m7GpppA帽子结构，3°-末端有1个poly（A)尾结构，共包含5个 开放式阅读框（openreadingfrane，ORF）。ORF1编码166kDa的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA- dependentRNApolymerase，RdRp），是PVX合成RNA必需的，也是唯一来源于自身的蛋白。中间的 ORF2、ORF3、ORF4相互重叠，被称为三基因区段（triple-geneblock，TGB），分别编码25kDa的 关，其中，TGBp1蛋白已经被证明是一种转录后基因沉默的抑制因子，可打破寄主植物的防御反应，使 病毒成功侵染。3-末端的ORF5编码25kDa的病毒外壳蛋白（capsidprotein，CP），除具有包装核酸的 功能外，也是病毒在细胞间移动所必需的，而且还能起到复制调节的作用。 另外，PVX基因组还包括5'-末端非翻译区域（5'-Untranslationalregion，5-UTR）和3'-端非翻译 区域（3'-Untranslationalregion，3'-UTR）。5'-UTR有84个核苷酸（nt），已有的研究表明，5-UTR对 种重叠的作用元件，其中包括1个富含U的八核苷酸序列，对于病毒RNA与寄主蛋白之间的互作以及 病毒的增殖起着重要作用。 4 GB/T 36833—2018 附录B （规范性附录） DAS-ELISA检测 B.1 试剂和材料 B.1.1 酶联板的要求 使用质量有保证厂商生产的酶联板。 B.1.2 包被抗体 特异性的马铃薯X病毒抗体。 B.1.3 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的马铃薯X病毒抗体 B.1.4 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。 PBST缓冲液（洗涤缓冲