ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 36871—2018 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和 猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法 Multiplex RT-PCR to detect porcine transmissible gastroenteritis virus porcine epidemic diarrhea virus and porcine rotavirus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36871—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：华中农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：何启盖、库旭钢、张坤、陈芳洲、范盛先、孟宪荣、陈品、姜雯、陈焕春 GB/T 36871—2018 猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和 猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪传染性胃肠炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）、猪流行 性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和猪轮状病毒（porcinerotavirus，PoRV）的多重 RT-PCR检测方法。 本标准适用于猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的核酸检测， 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（porcinetransmissiblegastroenteritisvirus) PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus） PoRV：猪轮状病毒（porcinerotavirus） RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline) TAE：电泳缓冲液（tris-acetate-ethylene diamine tetraacetic acid buffer) TCIDso：半数细胞感染量（mediantissuecultureinfectivedose） RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate)） 3试剂和仪器设备 3 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂应使用无RNA酶的容器分装。 3.1仪器 SAC 3.1.1 生物安全柜。 3.1.2 高速冷冻离心机。 3.1.3 组织匀浆器或研钵。 3.1.4 PCR仪。 3.1.5 水平电泳槽。 3.1.6 凝胶成像系统。 3.1.7 紫外透射仪。 3.1.8 2℃~8℃冰箱。 3.1.9 一20℃冰箱。 3.1.10 单道微量移液器（0.5μl~10μL10μL~50μL、20μL~200μL100μL1000μL等规格）。 3.2试剂 3.2.1 氯仿，常温保存。 1 GB/T 36871—2018 3.2.2 PBS（见附录A），常温保存。 3.2.31XTAE（见附录A），常温保存。 3.2.4 Trizol,4 ℃~8℃保存。 3.2.5 异丙醇,4℃～8℃保存。 3.2.6 DNA分子量标准，4℃～8℃保存。 3.2.7 DEPC处理水（见附录A），4℃～8℃保存。 3.2.8 阳性对照（PEDV、TGEV和PoRV分别经Vero细胞、PK-15细胞和MA-104细胞传代，病毒含 3.2.9 阴性对照（Vero细胞、PK-15细胞和MA-104细胞悬液），一20℃保存。 3.2.10 RNA反转试剂盒，一20℃保存。 3.2.11 多重RT-PCR方法中使用的各种引物对（见附录B）。引物干粉及稀释引物保存于一20℃。 3.3耗材 3.3.1 Eppendorf(EP)管。 3.3.2PCR管。 3.3.3吸头。 3.4 实验室分区 检测实验室要有相应的生物安全设施和不同功能分区，如样品处理区、核酸提取区、核酸电泳区、结 果观察区。各功能区要有专用的试剂和实验材料，不可交叉使用。 4样品的采集、处理、存放及运输 4.1样品采集和处理 4.1.1 生物安全及采样要求 4.1.1.1生物安全要求 样品采集及处理过程中应带一次性手套、口罩、防护帽，个人防护参见NY/T541。 4.1.1.2 采样要求 应采集出现腹泻症状12h～24h内猪的粪便、肛门拭子样品或剖检猪的小肠；母猪可采集乳汁（初 乳最佳）。采集母猪乳汁前要对乳房外表消毒；采集病变小肠时，先结扎拟采集肠道区域两端后，再剪取 该组织（防止肠内容物流出），将其全部放入样品袋内。每个样品要单独采集和分装，避免交叉污染。样 品避免接触甲醛或高温，以免降低检出率。 4.1.2粪便样品 用洁净的药匙和其他物品，刮取适量新鲜粪便，放置于EP管或其他洁净容器中。 4.1.3肛门拭子样品 4.1.3.1采集方法 将灭菌的医用棉签插人肛门（以棉签棉花部分全部插入肛门为准），同一方向转动3次，确保充分获 取粪便。 2 GB/T36871—2018 4.1.3.2样品处理 将肛门子放在盛有0.8mL灭菌PBS的无菌EP管中，涡旋或振荡10min，反复冻融2次，4℃ 条件下14600Xg离心10min，取上清转人新的EP管中，编号备用。 4.1.4肠道样品 4.1.4.1采集方法 选择充血、出血、肠壁变薄、含多量水样粪便等病变明显的小肠组织。提取模板前，用无菌剪刀剪取 约0.5cm×0.5cm，作为待检样品。 4.1.4.2样品处理 加入0.8mL～1.0mL的PBS混匀，组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨将组织混悬液转入无菌 EP管中，反复冻融2次，4℃条件下14600×g离心10min，取上清转人新的无菌EP管中，编号备用。 4.1.5母猪乳汁 4.1.5.1采集方法 用无菌EP管收集母猪产后乳汁2.0mL~3.0mL。 4.1.5.2样品处理 将乳汁转移到无菌EP管中，反复冻融2次，4℃条件下14600×g离心10min，取上清转人新的 EP管中，编号备用。 4.2存放与运输 采集的样品与冰块或干冰一起放入保温壶或保温箱，密封，在保温壶和保温箱外喷洒来苏尔或季铵 盐类消毒液，尽快送到实验室检测。采集或处理的样品在4℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长 期保存，应放置于一80℃冰箱，避免反复冻融。 5操作方法 5.1样品RNA的制备（Trizol法或RNA提取试剂盒） 5.1.1取1.5mL灭菌EP管，分别加入待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品各200μL，加入1mL Trizol溶液，剧烈振荡，静置5min。 5.1.2加人200uL氯仿，振荡，冰上静置7min。 5.1.34℃下，14600×g离心10min，取上清600μL，加人等体积异丙醇混勾后，冰上静置10min。 4℃下，14600×g离心7min，弃上清，加入800μL75%的冷乙醇；9800×g离心5min。 5.1.4弃上清，自然干燥5min，加20μLDEPC处理水溶解沉淀，即为RNA模板。 注：可使用商品化的RNA提取试剂盒，按其操作步骤提取RNA。 5.2反转录（cDNA的合成） 配制反转录反应体系，每管加人5.1.4中制备的RNA模板16μL和4μL5XRNA反转录反应混 合液（含Buffer、dNTP、M-MLV、RNA酶抑制剂、通用反转录引物等），37℃水浴15min或置于PCR 仪中37℃15min，反应结束后，经85℃15s灭活反转录酶，即为cDNA，直接用于PCR扩增或一20℃ 3 GB/T368712018 冻存备用。 5.3 3多重PCR扩增 PCR扩增体系配制如下。引物工作浓度均为10μmol/L。各种试剂添加完后充分混匀，瞬时离 心，使反应液全部集中于管底。 试剂 体积(μL) 2XPCR扩增MIX 12.5 PEDV P1/P2 各0.2 TGEVP3/P4 各0.4 PoRVP5/P6 各1.0 灭菌双蒸水 5.3 cDNA 4.0 共计 25.0 PCR扩增条件：94℃预变性5min后，94℃50s，55℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃ 延伸10min。扩增反应结束后取出产物置于4℃~8℃。 5.4扩增产物的电泳检测 5.4.1 称取适量琼脂糖配置浓度为1.5%的琼脂糖溶液，充分溶化后按1：10000加人溴化乙锭或新型 核酸染料（溴化乙锭替代物），倒人胶槽制备凝胶板 子量标准物（DL2000Marker）加到另一凝胶孔中。 5.4.3电泳，待染料移行到凝胶4/5距离，停止电泳 6 结果判定 6.1 1试验成立条件 含PEDV、TGEV和PoRV阳性对照材料，PCR扩增产物电泳后，同时出现大小约为663bp、 528bp和333bp的特异性条带，阴性对照材料无任何扩增产物（见图C.1），则试验结果成立；缺少任何 一条扩增产物或大小不符，则试验不成立。 6.2 结果判定 6.2.1检测结果分类 在试验成立的前提下，被检样品中可出现PEDV、TGEV和PoRV等3种病原的三重感染、二重感 染、单独感染（阳性）和均不感染（阴性）的结果。 6.2.2阳性结果 6.2.2.1 三重感染 出现大小约为663bp、528bp和333bp的3条特异性条带，判定为PEDV、TGE