ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T36850—2018 番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Tomato severe leaf curl virus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36850—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张永江、廖富荣、向均、冯黎霞、沈建国。 GB/T36850—2018 番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964植物病毒检测规范 3基本信息 中文名：番茄严重曲叶病毒 学名：Tomato severe leaf curl virus 缩写：ToSLCV 异名：番茄严重卷叶病毒 分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。 番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A 4 方法原理 番茄严重曲叶病毒（ToSLCV)的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据ToSLCV 与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）：依据ToSLCV的 基因组特征建立聚合酶链式反应（PCR）和环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法：通过这些方法的有 效组合，判断样品是否带有ToSLCV。 5 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）、高速离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、制冰机、 涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像 分析仪、酶标仪。 5.2用具 1 GB/T368502018 (1.5mL、2.0mL）、研钵、微型磨等。 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 见附录B;PCR检测试剂见附录C;LAMP检测试剂见附录D。 6抽样和样品制备 6.1抽样 有症状样品：取疑似病毒危害症状的样品；无症状：按照SN/T2122中规定执行 6.2 样品制备 样品制备按照SN/T2964规定执行。有明显症状的苗木，直接取症状部位1g单独制样，用于后 续检测；无明显症状的，可5株混合采样用于后续检测。 7检测鉴定 7.1DAS-ELISA检测 把制备的样品上清液加人已包被ToSLCV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平 行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染ToSLCV的植物组织作为阳性对照，样品提取 缓冲液作为空白对照；其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致。 具体操作见附录B。 7.2 2PCR检测 分别提取样品和对照的DNA后进行PCR检测，具体操作见附录C。 7.3 LAMP检测 分别提取样品和对照的DNA后进行LAMP检测，具体操作见附录D。 8结果判定 DAS-ELISA，PCR和LAMP中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带ToSLCV 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带ToSLCV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如叶片等样品保存在一80℃ 冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年。 9.2 结果记录 SZG 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值；PCR检测应有电泳图片和测序结果；LAMP检测应有反应管颜色图片。 2 GB/T36850—2018 附录A （资料性附录） 番茄严重曲叶病毒相关资料 A.1寄主范围 （Lepidiumspp.）、拟漆姑属（Spergulariaspp.）、苋属（Amaranthusspp.）及锦葵属（Malvaspp.）。 A.2 为害症状 侵染寄主植物导致植株矮化及叶片卷曲或皱缩。 A.3 分布地区 中美洲。 A.4 传播方式 主要通过烟粉虱（Bemisiatabaci）传播，也可通过嫁接传播。 A.5 粒体形态 病毒粒子为双联体结构，颗粒大小为18nmX30nm，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。 A.6 基因组 SAG 为单组分病毒，基因组DNA大小为2.5-2.6kb,包含AR1、AL1、AL2、AL3及AL4等5个阅读框 分别编码外壳蛋白、复制相关蛋白、转录激活蛋白、复制增强蛋白及C4蛋白。 3 GB/T36850—2018 附录B （规范性附录） 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） B.1试剂 B.1.1包被抗体 特异性的番茄严重曲叶病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的番茄严重曲叶病毒抗体。 B.1.3底物 对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。 B.1.4 1×PBST缓冲液（pH7.4) 氯化钠(NaCI) 8.0 g 磷酸二氢钾（KH,PO4) 0.2 g 磷酸氢二钠（NazHPO,） 1.15 g 氯化钾(KCI) 0.2 g 吐温-20(Tween-20) 0.5 mL 0.2 g 叠氮钠（NaN，） 溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000mL,4℃储存。 B.1.5样品抽提缓冲液（pH7.4) 亚硫酸钠（Na2SO.） 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，相对分子质量24000～40000） 20.0 g 溶于900mL的1XPBST中，并定容至1000mL，4℃储存 B.1.6 包被缓冲液（pH9.6) 碳酸钠（Na2CO：） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO，） 2.93 g 溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000mL，4℃储存。 B.1.7酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4) 1XPBST缓冲液 1 000 mL 牛血清白蛋白（BSA) 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，相对分子质量24000～40000） 20.0 g 4℃储存 4 GB/T36850—2018 B.1.8底物缓冲液(pH 9.8) 二乙醇胺 97 mL 0.1 g 氯化镁（MgClz） 溶于800mL灭菌双蒸水，用浓盐酸（HCl)调pH至9.8，定容至1000mL，4℃储存。 B.2实验步骤 B.2.1包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100uL。酶联板加盖或用保鲜膜 包好，37℃孵育2h。清空孔中溶液，用1XPBST加满各孔，3min后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。 再重复2次上述洗板过程。 B.2.2样品制备与加样 待测样品按1：10（1g样品加入10mL缓冲液）加人抽提缓冲液，在研钵中研磨；2000r/min离心 10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按100μL/ 孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照；酶联板加盖或用保鲜膜包好，4℃孵育过夜。酶 联板用自来水彻底冲洗，再用1XPBST洗涤3次，每次3min。 B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中，100μL/孔，酶联板 加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4h。酶联板用自来水彻底冲洗，再用1×PBST洗涤3次，每次3min。 B.2.4加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），100uL/孔加入到酶联板中， 室温避光孵育。 B.2.5读数 在不同的时间内如30min、60min、90min、120min或更长时间，用酶联仪在405nm处读吸光度 (OD)值。 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 对照孔的OD405值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔）应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性 对照孔的OD405值<0.15，当阴性对照孔的OD405值<0.05时，按0.05计算；阳性对照OD405值/阴性对 照OD405值>5；同一样品的重复性基本一致。 B.3.2结果判定 在满足B.3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下：样品OD405值/阴性对照OD405值明显 >2，判为阳性；样品OD405值/阴性对照OD405值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方 法加以验证；样品OD405值/阴性对照OD10a值明显<2，判为阴性。 若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判断。 21 5