ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36841—2018 桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Peach rosette mosaic virus 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36841—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、浙江大学。 本标准主要起草人：张永江、邱艳红、谈珺、廖富荣、向均、李金庆、吴建祥、辛言言。 GB/T368412018 桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了桃丛簇花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3基本信息 中文名：桃丛簇花叶病毒 学名：Peach rosette mosaic virus 缩写：PRMV 分类地位：伴生豇豆病毒科（Secoviridae）豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）线虫传多面体病毒属 (Nepovirus)。e 桃丛簇花叶病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 桃丛簇花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据，生物学测定为辅助鉴定手 段。根据PRMV与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS ELISA)和斑点酶联免疫吸附测定（Dot-ELISA）；依据PRMV的基因组特征进行逆转录聚合酶链式反 应(RT-PCR)检测。 5 仪器用具与试剂 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、制冰 机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成 像分析仪、酶标仪、洗板机、恒温水浴锅。 5.2用具 酶联板、可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）和可调移液器头、离心管 (1.5mL、2.0mL）、研钵、微型磨杆等 1 GB/T36841—2018 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA检测 试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C。 6检测样品的制备 6.1种子 种子播于灭菌土中，待长出幼苗后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（5株为1组）并 编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。 6.2 2苗木 有症状（如枝条变短丛簇、枝的节间缩短等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分 组方法和检测方法同6.1。 6.3 植物产品 植物产品有症状的部分（如叶片畸形、花叶、斑驳等）单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植 物产品，应按比例取样，分组编号，分组方法和检测方法同6.1。 7检测鉴定 7.1DAS-ELISA检测 把制备的样品上清液加人已包被PRMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行 加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染PRMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲 具体操作见附录B。 7.2 2RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C 7.3 生物学测定 将待测样品及阴性对照和阳性对照接种到鉴别寄主植物上，观察症状，具体操作见附录D。 7.4Dot-ELISA检测 把制备的样品上清液点在硝酸纤维素膜上，进行Dot-ELISA检测，对照设置同7.1。具体操作见附 录E。 8结果判定 DAS-ELISA,Dot-ELISA、RT-PCR和生物学测定中的两种检测方法结果为阳性即可判定样品携 带PRMV。 2 GB/T36841—2018 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 经检测确定携带PRMV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥室温环境中； 9.2 2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 鉴别寄主的症状照片。 3 GB/T 36841—2018 附录A （资料性附录） 桃丛簇花叶病毒相关资料 A.1寄主范围 自然寄主包括葡萄（Vitisvinifera）、桃（Prunuspersica）、李（Prunus salicina）、洋李（Prunusdo- mestica）、皱叶酸模（Rumercrispus）、药用蒲公英（Tararacumofficinale）等。鉴别寄主包括苋色藜 （Chenopodiumamaranticolor），昆诺阿藜（C.quinoa）、普通烟（Nicotianatabacum）等。 A.2危害症状 侵染桃树导致芽分化推迟，春天长出的叶子斑驳、变窄，有的畸形；枝条变短、丛簇；植株矮缩；不结 果或果实减少。 侵染葡萄导致叶片不对称和斑驳，枝条节间缩短；浆果脱落；蔓萎缩，最后死亡。 A.3分布地区 印度、土耳其、意大利、埃及、加拿大和美国。 A.4传播方式 传毒介体：美洲剑线虫（Xiphinemaamericanum）、折环长针线虫（Longidorusdiadecturus）、轮线 虫(Criconemoidesspp.)。 种苗：葡萄、桃、李等的无性繁殖材料如砧木、接穗等可传播；葡萄种子、昆诺藜种子及药用蒲公英种 子的种传率分别为9.5%90%和3.6%。 也可以通过机械接种、嫁接传播 A.5粒体形态 粒体为等轴对称球状正二十面体，直径约为24nm～30nm。 A.6 基因组 基因组为二分体基因组，核酸为正单链RNA，包括RNA1和RNA2两条链，分别为7kb和6.2kb 4 GB/T 36841—2018 附录B （规范性附录） DAS-ELISA检测 B.1试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的桃丛簇花叶病毒抗体。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的桃丛簇花叶病毒抗体。 B.1.3 3底物 对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。 B.1.4 41×PBST缓冲液（pH7.4) 氯化钠(NaCI) 8.0 g 0.2 g 磷酸二氢钾（KH,PO,) 磷酸氢二钠（NazHPO,） 1.15 g 氯化钾(KCI) 0.2 g 吐温-20(Tween-20) 0.5 mL 溶于900mL双蒸水中，并定容至1000mL，4℃储存。 B.1.5 5样品抽提缓冲液（pH7.4） 亚硫酸钠（NazSO） 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，相对分子质量24000～40000） 20.0 g 溶于900mL的1×PBST中，并用1XPBST定容至1000mL，4℃储存。 B.1.6包被缓冲液(pH 9.6) 碳酸钠（Na,CO） 1.59 g 碳酸氢钠（NaHCO.） 2.93 g 溶于900mL双蒸水中，并定容至1000mL，4℃储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4) 牛血清白蛋白（BSA） 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，相对分子质量24000～40000） 20.0 g 溶于900mL1×PBST中，并用1×PBST定容1000mL,4℃储存。 B.1.8 3底物缓冲液（pH9.8） 二乙醇胺 97 mL 5