ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36846—2018 马铃薯M病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Potato virus M 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36846—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、浙江大学 本标准主要起草人：刘忠梅、刘洪义、马微、陈定虎、栾凤侠、张永江、封立平、李明福、吴建祥、李桂芬 魏梅生、杨立群。 1 GB/T36846—2018 马铃薯M病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了马铃薯M病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。 本标准适用于可能带有马铃薯M病毒的马铃薯植株、繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB7331马铃薯种薯产地检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3马铃薯M病毒基本信息 3 中文名：马铃薯M病毒 学名：Potato virus M 缩写：PVM 异名:Kartoffel-Rollmosaikvirus,Ksrtoffel-K-virus,Potato interveinal mosaic virus,Potato leaf rolling mosaic virus, Potato M carlavirus, potato paracrinkle virus, Potato virus E, Solanum virus 11, Solanum virus 7 分类地位：乙型线状病毒科（Betafleaiviridae），香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）。 传播途径：该病毒可通过机械接种传播和蚜虫的非持久性传播，也可通过种薯、商品薯、组培苗等繁 殖材料远距离传播。 马铃薯M病毒的其他信息参见附录A。 方法原理 4 PVM的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVM免疫原性建立酶联免疫吸 PCR(RT-PCR)和反转录环介导等温扩增（RT-LAMP)检测方法。 5仪器设备、用具及试剂 5 5.1仪器设备 酶标仪、PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、PH计、凝胶成像 系统、制冰机、超净工作台、高压灭菌锅、低温冰箱、电子天平（0.001g）、涡旋振荡器、恒温培养箱等 5.2用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）、吸头、离心管和研钵等。 1 GB/T36846—2018 5.3试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)所需试剂见附录B,RT-PCR检测所需试剂见附录C， RT-LAMP检测所需试剂见附录D,dot-ELISA检测所需试剂见附录E。 6抽样与样品制备 6.1抽样 马铃薯贸易商品、科研用薯材料、国际间种质交流材料及其他寄主植物等现场抽样按照SN/T2122 的规定执行，田间调查采样按照GB7331的规定执行。 6.2马铃薯组培苗、微型薯、块茎等样品的制备 将马铃薯组培苗、微型薯、块茎播于非土介质或灭菌土中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长 出3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。表现 可疑症状的繁殖材料，可直接用于检测，必要时再进行栽培生长实验 6.3茄科等寄主植物种子样品的制备 将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌王中，于25℃左右生长并进行症状观察。待长出 3片～4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。 7检疫鉴定方法 7.1DAS-ELISA检测 见附录B。如果使用试剂盒，应按照说明书进行操作。 7.2 2RT-PCR检测 见附录C。 7.3 3RT-LAMP检测 见附录D。 7.4dot-ELISA检测 见附录E。 8结果判定 样品检测时，可采用DAS-ELISA，dot-ELISA或RT-LAMP检测进行初步筛检。检测流程及结果 判定按下述原则进行： 经过血清学检测（7.1、7.4任选其一），若检测结果为阳性，采用RT-PCR方法（7.2)进行验证， 验证结果为阳性，则判定样品检出PVM： 经过分子检测（7.3），若检测结果为阳性，采用血清学检测（7.1、7.4任选一种）进行验证，验证 2 GB/T36846—2018 结果为阳性，则判定样品检出PVM； 经过血清学检测（7.1、7.4任选其一）或分子检测（7.3），若检测结果为阴性，则判定样品未检 出 PVM。 9 样品保存与结果记录 9.1样品保存 或一80℃冰箱中，并作好标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期限至少1年，保存期满后，应 经灭活处理。 9.2 2结果记录 完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验 人员的签字；酶联免疫吸附方法应有酶联反应的原始数据，dot-ELISA检测应附显色图片，RT-LAMP 检测应附结果图片，RT-PCR检测应有电泳结果图片和测序结果。 3 GB/T368462018 附录A （资料性附录） 马铃薯M病毒相关资料 A.1寄主范围 tuberosumL.）、迪勃纳氏烟草（又名德氏烟）（Nicotianadebneyi）、千日红（Gomphrenaglobosa）、番茄 （Lycopersiconesculentum）、洋金花（Daturametel）、人参果（Solanummuricatum）等。 A.2地理分布 美国、加拿大、墨西哥、阿根廷、巴西、智利、英国、德国、法国、荷兰、爱沙尼亚、奥地利、白俄罗斯、保 加利亚、波兰、丹麦、俄罗斯、芬兰、荷兰、捷克、斯洛伐克、拉脱维亚、罗马尼亚、前南斯拉夫、瑞典、匈牙 利、意大利、埃及、马拉维、巴基斯坦、哈萨克斯坦、韩国、日本、塞浦路斯、印度、印度尼西亚、中国及大洋 洲等国家和地区。 A,3危害症状 依PVM株系和品种不同，感病症状有一定差异。其强株系侵染后，马铃薯幼苗期小叶表面带有油 脂状光泽，同时小叶迅速开始向下卷曲，叶背出现条斑坏死，随着马铃薯生长发育，下部叶片出现不规则 的坏死斑点，并很快黄化至干枯，枯叶下垂现象似马铃薯Y病毒（PVY）的重垂叶坏死症，病株严重萎缩 和矮化，其株高只相当于健株的1/3高度，叶背向卷曲似马铃薯卷叶病毒（PLRV）。PVM的弱毒株系 侵染马铃薯后，常引起病株小叶脉间花叶，小叶尖端稍扭曲，叶缘呈波状，病株顶叶有些卷叶或叶面表现 无光泽，如图A.1所示。 注：引自http://www.eestikartul.ee/kasvatus/kartulihaigused。 图A.1PVM侵染马铃薯植株的症状 A.4基因组 病毒粒体为病毒粒体微曲线状，大小约650nm×12nm，正义单链RNA，全长约8.5kb，含6个开 放阅读框（ORF），分别编码复制酶蛋白、运动蛋白三基因框、外壳蛋白及富含半胱氨酸的蛋白。目前 GenBank已登录有PVM全基因组序列。 GB/T 36846—2018 附录B （规范性附录） DAS-ELISA检测 B.1 试材 B.1.1 酶联板 使用质量有保证厂商生产的酶联板。 B.1.2 包被抗体 特异性的PVM抗体。 B.1.3 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的PVM抗体。 B.1.4 底物 对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。 B.1.5 PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4） NaCI 8g Na, HPO 1.15 g KH,PO4 0.2 g KC1 0.2 g 吐温-20(Tween-20) 0.5 mL NaN: 0.2 g 蒸馏水定容至1L，4℃储存 B.1.6 样品抽提缓冲液（pH7.4） PBST 1 L Naz SO; 1.3 g PVP(MW24000~40000) 20 g NaN: 0.2 g 4℃储存。 B.1.7 包被缓冲液（pH9.6） Naz CO: 1.59 g NaHCO3 2.93 g NaN: 0.2 g 蒸馏水定容至1L，4℃储存 5