ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T36852—2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Erwinia pyrifoliae 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36852—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、南京农业大学、中华人民共和国上海出人境检验检疫 局、浙江大学、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：赵文军、田茜、胡白石、田艳丽、易建平、楼兵干、李红叶、葛泉卿。 GB/T36852—2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了亚洲梨火疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测方法 监测。 2 亚洲梨火疫病菌基本信息 中文名：亚洲梨火疫病菌 学名:Erwinia pyrifoliae Kim et al. 英文名：Shootblightof Asianpear 菌目（Enterobacteriales），肠杆菌科（Enterobacteriaceae），欧文氏菌属（Erwinia）。 传播途径：染病的梨的繁殖材料（包括种苗、木和接穗）、昆虫、风、雨、以及被污染的包装材料和运 输工具等许多自然因素和人为因素都可引起亚洲梨火疫病的传播。其中，染病的梨的繁殖材料是亚洲 梨火疫病远距离传播的主要途径。 亚洲梨火疫病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据亚洲梨火疫病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据亚洲梨火疫病菌的特异性 DNA序列进行分子生物学检测；根据亚洲梨火疫病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等 对病原菌进行分离培养及致病性测定。 4仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备及用具 超净工作台、恒温培养箱、摇床、超低温冰箱、常规冰箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、小型离心机、高速 冷冻离心机、显微镜、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、制冰机、电子天 平、涡旋振荡器、微量进样器、烘箱等。 4.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。分子生物学检测所需试剂见附录B和附录C。 5检疫鉴定方法 5 5.1症状检查 参照附录A中的症状描述检查植株有无亚洲梨火疫病的典型症状，主要检查嫩梢、花、幼果和枝干 1 GB/T36852—2018 等部位。观察嫩梢是否出现萎焉（拐杖状）、变黑枯死；花和幼果是否变黑枯死；叶脉是否从叶柄基部向 上变黑；枝干是否有溃疡斑；以及病组织上是否有菌脓。对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记 录，并采集表现症状的嫩梢、花簇、枝干，幼果等送实验室检测鉴定。对于无症的幼嫩枝条，应重点对其 顶端和基部取样。 5.2样品的制备 5.2.1显症植株样品的制备 疑似样本采集后应尽快检测，若不能及时检测，样本应在4℃～8℃下保存，尽可能不要超过一周。 采集样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染。 样品处理应采用对分离培养、免疫学和分子生物学检测都有效的通用程序。为了成功进行富集，要 使用新制备的抗氧化剂浸渍缓冲液［聚乙烯吡咯烷酮（PVP)-10,20g；甘露醇，10g；抗坏血酸，1.76g； 还原型谷胱甘肽，3g；磷酸盐缓冲液（PBS），10mM，1L；pH7.2；过滤除菌」。样品也可以用无菌蒸留 水或pH7.2的PBS(NaCl,8g;KCl,0.2gNazHPO·12H,O,2.9g;KH,PO4.0.2g；蒸馏水，1L)处 理，直接用于分离培养、免疫学或分子生物学检测。 应尽可能选择表现出最典型症状并带有菌浓的植物部位（花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实）。处理用 的材料挑取病健交界部位，将植物组织切成大约0.1g1.0g的小块，放入装有适量抗氧化剂浸渍缓冲 液、PBS或无菌蒸留水的离心管或培养血中轻轻挤压，静置至少5min，并在冰块上放置儿分钟，即制成 样品悬浮液，用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。 5.2.2无症植株样品的制备 无症状样品可单个处理（最好如此），或者最多10个一组。采集样品时和提取过程中应小心避免交 叉污染。 在3月下旬到6月底，即梨树开花期开始到果实膨大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，装人无菌袋或 容器中。从疑似植株上剪下长度约为20cm的嫩梢，或花期时的花器。如果在冬天进行分析，要从每株 叶片的叶柄基部，或茎段。称取0.1g～1.0g植物材料，浸渍在按照5.2.1描述抗氧化剂缓冲液中，制成 样品悬浮液。 因为细菌菌群少，对无症状样品直接进行检测时通常对亚洲梨火疫病菌表现为阴性。因此，在检测 无症状材料时，应在25℃左右对用抗氧化剂缓冲液制备的样品进行72h富集。 建议使用两种经过验证的液体培养基进行富集，一种为非选择性（金氏B培养基），另一种为半选 择性（CCT培养基）。取制备的样品浸出液0.9mL分别加人两个各装有0.9mL液体富集培养基（无琼 脂的金氏B和使用营养肉汤而非营养琼脂制备的CCT培养基）的10mL～15mL的无菌试管中（确保 通风良好）。试管在25℃下无震荡培养48h～72h。在处理冬天采集的植物样品时建议培养更长时 间。取适量样品富集培养液用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。 CCT培养基分两部分制备。第一部分含：蔗糖，100g；山梨糖醇，10g；硫酸四癸钠，1.2mL；结晶 紫，2mL（0.1%乙醇溶剂）；营养琼脂，23g；蒸馏水，1L；pH7.0~7.2115℃高压灭菌10min。将灭过 菌的培养基冷却至大约45℃。第二部分含：硝酸铊2mL（质量浓度为10g/L)；放线菌酮，0.05g；过滤 除菌。将第二部分加入1L无菌的第一部分培养基中。 金氏B培养基含：蛋白陈，20g；甘油，10mL；K,HPO，1.5g；MgSO：7HzO,1.5g；琼脂，15g；蒸 馏水，1LpH7.0~7.2;120℃高压灭菌20min。 5.3免疫学检测 采用商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。若检测结果为阴性，直接判 2 GB/T36852—2018 定为未检出亚洲梨火疫病菌。若检测结果为阳性，需进行分离培养鉴定及致病性测定。亦可不进行免 疫学检测，直接进行分子生物学检测。 5.4分子生物学检测 5.4.1模板制备 对于植株样品，按照步骤5.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集培养液后，直接用商业化植物基 10min，取上清液，一20℃保存）作为分子生物学检测反应模板。 5.4.2PCR凝胶电泳检测 以E.pyrifoliae标准菌株作阳性对照，用非E.pyrifoliae的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替 除因核酸提取失败、降解，或因存在PCR抑制剂而引起PCR假阴性的可能性。具体检测步骤见附 录 B。 5.4.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测具体步骤见附录C，对照及植物内对照设置同5.4.2。 5.5分离培养鉴定 按照5.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集培养液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在溶菌肉汤 (LB)培养基平板上划线分离，或者用无菌水对样品悬浮液进行10倍梯度稀释，各取100μL稀释液涂 板分离，各重复3次。25℃恒温培养24h～48h，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行 致病性测定、Biolog鉴定、免疫学或分子生物学鉴定。 在LB培养基上，亚洲梨火疫病菌形成与梨火疫病菌相似的乳白色菌落，但梨火疫病菌在LB蔗糖 果聚糖，菌落较小略有凸起。常见的污染菌草生欧文氏菌Eriniaherbicola在LB上形成黄色菌落， 因此可以排除 LB培养基配制方法：胰蛋白陈10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，加双蒸水至1000mL， 调节pH至7.5，湿热灭菌（121℃，15min）。 5.6Biolog鉴定 利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定。 5.7致病性测定 5.7.1幼果接种试验 取梨幼果（直径大约3cm～5cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置垫有灭菌滤纸的培养皿上（加 少量无菌水）。用接种针蘸取在LB培养基上培养24h～36h的待鉴定菌落，针刺接种到幼果的果肉组 织，一个横切面接种3个点～4个点。接种后，26℃保湿培养，诱导发病和菌脓的形成。大约24h后， 观察接种部位有无坏死和菌脓产生。实验以无菌水为对照。 5.7.2枝梢接种试验 剪取梨树当年生的幼嫩枝梢，插于盛有自来水的三角瓶中，用接种针蘸取在LB培养基上培养24h～ 3 GB/T36852—2018 36h的待鉴定菌落，刺伤接种到顶端生长点下约5cm～10cm处；也可刺伤后，在刺伤点接种1滴 （3μL～5μL）浓度为10CFU/mL的病菌悬浮液。接种后套袋25℃C左右保湿培养，2d～3d后观察接 种点是否出现变黑、组织干癌、枝梢萎為等症状及是否出现菌脓。 6结果判定 依据表1进行检测结果判定。 表 1 免疫学或分子 Biolog鉴定 分离培养鉴定 致病性测定 结果判定 生物学检测 (可选） 任一方法阳性 阳性 阳性 阳性 样品检出亚洲梨火疫病菌 任一方法阳性 阴性 样品未检出亚洲梨火疫病菌 任一方法阴性 样品未检出亚洲梨火疫病菌 一 其中，分子生物学检测可根据实验室条件，选择5.4.2或5.4.3中的任意一种进行检测，任意一种检 测方法的结果为阳性则判定分