ICS 07.080 C 27 中华人民共和国国家标准 GB/T 36755—2018 BSTDNA聚合酶 BST DNApolymerase 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36755—2018 目 次 前言 引言 IN 范围 1 2 规范性引用文件 3术语和定义 技术要求 4 5 检验方法 6包装、运输及贮存· 保质期 7 附录A（规范性附录） BST酶活力检测 附录B（规范性附录） 核酸外切酶检测 附录C（规范性附录) 核酸内切酶检测 GB/T36755—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶标准化工作组（SAC/SWG11)归口。 本标准起草单位：中国科学院微生物研究所、厦门致善生物科技股份有限公司、福建华灿制药有限 公司、福建南生科技有限公司、安琪酵母股份有限公司、上海博仕生物医学服务中心、北京化工大学。 本标准主要起草人：李晶、宋娜杰、黄发灿、刘文军、詹学雄、郑登忠、李庆阁、赵晶、章丽丽、姚鹃、 邢志刚、陈劲春。 Ⅲ GB/T36755—2018 引 BSTDNA聚合酶（BSTDNApolymerase）是嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus） DNA聚合酶的一部分，具有5'→3'DNA聚合酶活性，但不具有5'→3'外切核酸酶活性。制定BST DNA聚合酶国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于BSTDNA聚合酶的生产和使用具有重要 意义。 IV GB/T 36755—2018 BSTDNA聚合酶 1范围 本标准规定了BSTDNA聚合酶的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。 本标准适用于通过基因重组表达中提取的BSTDNA聚合酶。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T191包装储运图示标志 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 BSTDNA聚合酶 BSTDNApolymerase 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的一部分，具有5'→3'DNA聚合酶 活性，但不具有5→3'外切核酸酶活性 3.2 BSTDNA聚合酶活性单位 activity unit of BST DNA polymerase 以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物，在65℃、1min内，将1.29nmol脱氧核苷酸聚合成 双链DNA中所需的酶量为1活力单位（U）。 4 技术要求 4.1 外观 澄清透明的液体，无沉淀。 4.2 2酶活力 ≥8 000 U/mL。 4.3 3杂质 不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。 检验方法 5.1 外观 直接或将样品倒人无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。 1 GB/T36755—2018 5.2 2酶活力 依据附录A的方法进行检测。 5.3 杂质 5.3.1核酸外切酶 依据附录B的方法进行检测。 5.3.2核酸内切酶 依据附录C的方法进行检测。 6 包装、运输及贮存 6.1 包装 内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定。 6.2 运输 产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防 护措施避免倒置及破损。不宜与有毒、有害、有异味物品混运。 6.3 3贮存 应在温度低于一20℃的条件下储存。 7 保质期 在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为3年；超过保质期，使用前应检测 酶活。 2 GB/T36755—2018 附录A （规范性附录） BST酶活力检测 A.1仪器设备 荧光PCR仪。 A.2试剂 A.2.1发夹型寡核苷酸序列（T2）,序列为： 5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3 A.2.2 dNTP. 注：dGTP：三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸；dATP：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸；dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸； dCTP：三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸。dNTP指三磷酸碱基脱氧核苷酸，包括dGTP、dATP、dTTP、dCTP。 A.2.3荧光核酸染料。 A.2.4LamdaDNA标准品。 A.3试剂溶液配制 A.3.11XTE溶液:10 mmol/LTris-HCl,1mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，pH8.5(25℃)。 A.3.2PCR缓冲液：250mmol/LTris-HCl,50mmol/L硫酸铵溶液，500mmol/L氯化钾溶液，1%（体 积分数）TritonX-100.pH8.5（25℃）。 A.3.3LambdaDNA预染液：以8.5μL：1μL:0.5μL的比例分别量取纯化水、10XPCR缓冲液和荧光 核酸染料加人离心管，在漩涡混匀器上振荡混匀1min后在微型离心机上离心数秒，储存于2℃～ 8℃。 A.3.4氯化镁溶液：25mmol/L。 A.3.5酶稀释缓冲液：10mmol/LTris-HCl,0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液，lmmol/LDTT， 50%（体积分数）甘油，pH8.0（25℃）。 A.3.6T2溶液：将发夹型寡核苷酸序列（T2）干粉按照合成单上的说明稀释到100μmol/L，储存于 一20℃。使用时从一20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒 A.3.7dNTP混合液：将dNTP中的dCTP、dATP、dTTP、dGTP等体积进行混合，于漩涡混匀器上混 匀10s，在微型离心机上离心数秒，配制成浓度为25mmol/L的dNTP混合液。 A.3.8LambdaDNA标准品：使用1XTE溶液将LambdaDNA标准品进行4倍连续梯度稀释，得到 100μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL3.125μg/mL、1.5625μg/mL和0.78125μg/mL的 8个浓度梯度溶液，以相同体积的1XTE溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积 的预染液，于漩涡混勾器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒，以20μL/管分装于PCR八联管内，每 3