ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35900.3—2018 动物流感检测 第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸 双重荧光RT-PCR检测方法 Animal influenza detectionPart 3 : Method of duplex real-time RT-PCR for the detection of H1 and H3 subtype influenza virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35900.3—2018 前言 GB/T35900《动物流感检测》目前分为3个部分： 第1部分：H1亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； 一第2部分：H3亚型流感病毒核酸荧光RT-PCR检测方法； 一第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸双重荧光RT-PCR检测方法。 本部分为GB/T35900的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局 本部分主要起草人：蒲静、高志强、谷强、刘环、吴丹、乔彩霞、张伟、张鹤晓、张利峰 1 GB/T 35900.3—2018 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本文件4.1.8与“H1和H3亚型流感 病毒双重荧光RT-PCR检测引物和探针序列”相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意向任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。 地址：北京市朝阳区甜水园街6号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 GB/T35900.3—2018 动物流感检测 第3部分：H1和H3亚型流感病毒核酸 双重荧光RT-PCR检测方法 1范围 GB/T35900的本部分规定了同时检测H1和H3亚型流感病毒核酸的双重荧光RT-PCR操作 方法。 本部分适用于禽和猪及其产品中H1和H3亚型流感病毒核酸的检测 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光RT-PCR实时荧光反转录聚合酶链反应（real-timereversetranscriptpolymerasechainre action) BHQ1 无荧光淬灭基团（blackholequencher-1） Ct(或 Cp)值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold，or crossing point) cRNA 互补RNA(complementRNA) DEPC 焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） FAM 羧基荧光素（carboxyfluorescein） HA 血凝素(hemagglutinin) HEX 六氯-6-甲基荧光素（hexachlorofluorescein） LNA 锁核酸(locked nucleic acid) MGB 小沟结合物（minorgroovebinder） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline） RNA 核糖核酸(ribonucleic acid) 试剂和材料 4 4.1试剂 4.1.1总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。 1 GB/T35900.3—2018 4.1.2 TRIzol:2℃~25℃保存。 4.1.3 氯仿：2℃~8℃预冷。 4.1.4 异丙醇：一20℃预冷。 4.1.5 DEPC水：见附录A中A.1。 4.1.6 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷 4.1.7 PBS（含牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）：配方见A.2。 4.1.8 引物和探针序列及反应液配方：见附录B。 4.1.9 阳性对照为灭活的H1和H3亚型动物流感病毒混合液，或H1和H3亚型流感病毒HA基因体 外转录cRNA混合液；阴性对照为已知流感病毒阴性的禽或猪组织悬液。 4.2 仪器设备及耗材 4.2.1 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。 4.2.2 高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）。 4.2.3台式离心机。 4.2.4振荡器。 4.2.5组织匀浆器。 4.2.6冰箱（2℃~8℃和-20℃两种）。 4.2.7微量移液器（5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头（无核酸酶）。 4.2.81.5mL离心管（无核酸酶）和5mL采样管。 5 实验室的标准化设置与生物安全管理 SAC 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1—2004附录C；实验室生物安全管理见GB19489。 6样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。 6.2采样及处理工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、一次性采样袋。 6.2.2除棉拭子和采样袋外，上述取样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤 2 h。 6.3样品采集 6.3.1拭子样品 活动物采集拭子样品。根据动物种类可采集咽喉拭子、泄殖腔拭子（禽类）或鼻拭子（猪）。采集方 法如下： 取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液； 取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； 取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物。 2 GB/T 35900.3—2018 6.3.2组织样品 病死动物采集肺脏或气管等组织。用无菌剪、镊采集待检组织，装入一次性采样袋或其他灭菌容 器，编号。 6.4样品贮运 样品采集后置保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，24h内送实验室。 6.5样品处理 6.5.1拭子样品 样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3000r/min离心5min，吸取上清液1.0mL转 人无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 6.5.2组织样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵或组织勾浆器中充分研磨，再加10.0mLPBS（含 牛血清白蛋白、青霉素和链霉素）混匀，3000r/min离心5min后，取1.0mL上清液转人无菌1.5mL 灭菌离心管中，编号备用。 6.6样品存放 采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱， 但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。 7操作方法 7.1样品核酸提取 7.1.1在样本制备区进行，采取TRIzol裂解法提取；也可采用其他等效的RNA提取方法。 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号。 7.1.3每管加入600μLTRIzol。 7.1.4每管对应编号分别加入200μL待检样品、阳性对照或阴性对照，混匀。 7.1.5每管加入200μL氯仿，充分颠倒混匀。于4℃、12000r/min离心15min。 7.1.6新取n个灭菌的1.5mL离心管，逐管编号，每管加入500μL异丙醇（一20℃预冷）。 混匀。 7.1.8于4℃、12000r/min离心15min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸 水纸不同地方沥干。 7.1.9每管加人600μL75%乙醇（一20℃预冷），颠倒洗涤。 7.1.10于4℃、12000r/min离心10min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在 吸水纸不同地方沥干。 7.1.114000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器尽量将其吸干。注意一 份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面。 7.1.12室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。 7.1.13每管加人11μLDEPC水，轻轻混勾，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，获得RNA溶 3 GB/T35900.3—2018 液，冰浴保存备用（4℃保存不超过8h，若需长期保存应放置一70℃冰箱）。 7.2扩增试剂的准备与配制 7.2.1反应混合物配制区进行。 制反应液，充分混匀后分装，每个反应管40uL。转移反应管至样本制备区。 7.3加样 7.3.1在样本制备区进行。 7.3.2在上述7.2.2的反应管中分别加人7.1.13中制备的RNA溶液10μL，使每管总体积达到50uL， 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。 7.4荧光RT-PCR反应 7.4.1在检测区进行。 7.4.2应使用能采集并区分FAM和HEX这两种不同荧光信号的多通道荧光PCR仪。 7.4.3将7.3.2中加样后的反应管放入荧光PCR检测仪内，编辑样品表后，选定FAM检测通道读取 感病毒核酸的检测结果，并选择BHQ1作为无荧光淬灭基团。反应参