ICS 07.080 A40 中华人民共和国国家标准 GB/T 35918—2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法 Identification of animal origin in animal products by DNA barcoding- Sanger sequencing 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35918—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、黄文胜、王斌、韩建勋、刘鸣畅、张九凯、邓婷婷 GB/T35918—2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法 1范围 本标准规定了基因条码技术Sanger测序法的原理、主要试剂、主要仪器设备、样品采集与制备、检 验步骤、质量控制、结果判定与表述、检验过程中防止交叉感染的措施。 本标准适用于以哺乳类、禽类、鱼类动物的肉、乳、血液、毛发、角骨、内脏、皮张等来源的动物制品及 饲料物种的定性检测 注1：物种参见资料性附录A。 注2：基因条形码技术Sanger测序法的检出限为10%（质量分数）。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9695.19F 肉与肉制品取样方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T19495.3—2004转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T21104动物源性饲料中反动物源性成分（牛、羊、鹿）定性检测方法PCR方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T3500—2013进出口食品安全生物学检测抽样规范 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 基因条码DNAbarcode 生物体一段公认的能够代表该物种的标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.1.2 Sanger测序法Sanger sequencing 双脱氧链终止法 以单链或双链DNA为模板，在DNA聚合酶的催化下延伸结合在模板上的引物，直到掺人一种链 终止核苷酸为止。每个反应含有四种dNTP，并混入用同位素或荧光标记的ddNTP，使延长的寡聚核 苷酸选择性终止，通过高分辨率变性毛细管电泳分离片段获得碱基顺序的方法 3.1.3 基因条码技术DNAbarcoding 采用基因测序技术对物种的基因条码进行识别，利用其种内特异性和种间多样性实现对物种的快 1 GB/T35918—2018 速鉴定的技术。 3.1.4 质量评分Qualityvalue；QV 仪器测序过程中，软件分析测序信号时，根据预测到的碱基解读错误率，给出针对每个碱基所对应 的质量评分，用以评估单个碱基的测序质量 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BOLD：生命条形码数据系统（TheBarcodeofLifeDataSystem） bp：碱基对(Basepair) CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（CetyltrithylammoniumBromide） DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphate） ddNTP：双脱氧核糖核苷三磷酸（DideoxyribonucleosideTriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiaminetetraaceticAcid) NCBI：美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation） QV：质量评分（QualityValue） TaqDNA聚合酶：耐热DNA聚合酶（TaqDNAPolymerase） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷［Tris(hydroxymethyl）Aminomethane] 4原理 基于基因条码技术，根据样品类型选择基因条码引物，扩增基因条码序列并双向测序，在数据库中 对序列进行比对，确定物种。 5 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T6682中二级水的要求 5.1 Taq DNA 聚合酶。 5.2胶回收试剂盒。 5.3 3分子量标准品（最小片段≥20bp，最大片段<2000bp）。 5.4琼脂糖。 5.5 溴化乙锭。 5.6 6三氯甲烷。 5.7异丙醇。 5.8 3无水乙醇。 5.9 dNTP混合液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。 5.10 10XPCR缓冲液。 5.11 无菌双蒸水。 5.12 70%乙醇。 5.13 1.2 mol/L NaCl溶液。 5.14 20mg/mL蛋白酶K溶液。 5.15 10X电泳缓冲液：Tris54g/L,硼酸27.5g/L,10mmol/LEDTA，pH8.0。 2 GB/T35918—2018 5.16蛋白酶K缓冲液：1XPCR缓冲液：20mg/mL蛋白酶K=1：1000。 5.17CTAB提取液:20.00g/LCTAB,81.9g/LNaCl,12.1 g/LTris,7.50 g/LNa,EDTA,pH8.0。 5.18 CTAB沉淀液：5.00g/LCTAB,2.50g/LNaCl.pH8.0。 6 主要仪器设备 6.1 PCR仪。 6.2凝胶成像仪。 6.3 电泳仪。 离心机：离心力17000g。 6.4 6.5 核酸蛋白分析仪。 6.6 Sanger测序仪。 6.7 组织研磨器。 6.8 涡旋混勾仪。 6.9 pH计：精度为0.01。 6.10 微量移液器：0.5μL~10μL,10μL~100μL，20μL~200μL,200μL~1000μL。 6.11 天平：分度值0.1mg 7 样品采集与制备 7.1采样 采样抽样参见GB/T9695.19.GB/T14699.1和SN/T3500—2013。 7.2制备 7.2.1总则 样品充分混匀，分成三等分，作为检样、复检样和贮存样，样品的制备应防止交叉污染和组分改变。 7.2.2肉品 从不同部位分别采集适量样品后混合，依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2次～3次，收集到50ml 离心管或密封袋中，一20℃以下冻存。 7.2.3乳及乳制品 液态乳制品混匀，直接分装一20℃以下冻存。固态乳制品粉碎，收集到50mL离心管或密封袋中， 4℃～8℃保存。乳粉混匀后直接分装，收集到50mL离心管或密封袋中，4℃～8℃保存。 7.2.4皮张、角骨、内脏等 冻存。 7.2.5血液 直接滴于采血卡上，晾干后，一20℃以下冻存。 3 GB/T35918—2018 7.2.6毛发样品 分别用70%乙醇和无菌双蒸水冲洗2次～3次，收集到密封袋中，4℃～8℃保存。 7.2.7饲料 混后直接分装，收集到50mL离心管或密封袋中，4℃～8℃保存。 8检验步骤 8.1 实验设置 检测设置阳性对照和空白对照（无菌双蒸水），其中阳性对照和空白对照DNA提取1次，待检样品 提取设置2个重复；所有DNA样品的PCR扩增设置2个重复。 8.2DNA提取 8.2.1肉、乳、角骨、皮张、内脏等 按GB/T19495.3一2004中C.6.2CTAB-2中的试验方法，并根据实际需要加入2mL~10mL CTAB提取液，同时加人20μL~100μL20mg/mL蛋白酶K（乳品等蛋白含量高的样品，用量增加 1倍），65℃温育1h～2h，期间不时震荡混匀。最后用50μL～100uL无菌双蒸水溶解DNA，混匀， 一20℃以下冻存。 8.2.2血液 用采血卡剪取直径3mm左右的血斑于2mL离心管中，DNA提取方法参见B.1。 8.2.3毛发 取清洗好的毛发，将毛囊端朝下放入200μL离心管，剪去末端，加人20μL蛋白酶K缓冲液，65℃ 8.2.4饲料 饲料DNA提取方法按照GB/T21104的规定执行。 上述方法均可使用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 8.3 3DNA浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。 DNA的浓度按式（1)计算，每个样品重复测3次，取平均值。通过OD260/OD280比值判断提取出的DNA 的纯度。若OD260/OD280值在1.7～2.1之间，说明DNA纯度较高 C=AXNX50/1000 ..(1) 式中： C——DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)； A-——260nm处的吸光值； N——核酸稀释倍数。 4 GB/T 35918—2018 8.4PCR扩增 8.4.1引物 扩增和测序引物见附录C。 8.4.2反应体系 采用TaqDNA聚合酶扩增，酶及扩增体系参见B.2。 8.4.3反应参数 哺乳类、禽类、鱼类及微型基因条码反应参数分别见表C.1～表C.3。 8.4.4电泳检测 取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加人溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5ug/mL， 制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将25μLPCR扩增产物分别和适量加样缓 冲液混合，点样，同时点加分子量标准品，9V/cm电泳仪中恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中 部。用凝胶成像仪