ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35909—2018 猪肺炎支原体PCR检测方法 Detection of mycoplasma hyopneumoniae using PCR method 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35909—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准起草人：邵国青、冯志新、熊祺琰、刘茂军、张磊、王海燕、武昱孜、韦艳娜、刘蓓蓓、甘源、华利忠， 王佳、王丽。 1 GB/T 35909—2018 猪肺炎支原体PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪肺炎支原体PCR检测的操作方法 本标准适用于实验室对猪临床样品（猪鼻拭子、肺组织和支气管肺泡灌洗液）、细菌培养物和动物产 品中猪肺炎支原体核酸的快速检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范 动物检疫 病死及病害动物无害化处理技术规范农医发[2017]25号 兽医实验室生物安全管理规范（中华人民共和国农业部公告第302号） 3术语和定义及缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 猪肺炎支原体 Mycoplasmahyopneumoniae;MHP 支原体科支原体属（Mycoplasma）成员，是猪支原体肺炎（MPS）的主要病原体。 注：猪支原体肺炎又称猪气喘病，是一种经呼吸道感染的慢性病，对养猪业造成严重危害。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer） TAE TAE电泳缓冲液（tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic acidbuffer) TBETBE电泳缓冲液(tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid buffer) Taq酶TaqDNA聚合酶(Taq DNApolymerase) dNTPs 脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates) DNAJ 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) CCU 颜色变化单位（color changeunit) MPS 猪支原体肺炎（mycoplasmalpneumoniaofswine） 1 GB/T35909—2018 4仪器设备 4.1 高速冷冻离心机。 4.2 核酸电泳仪。 4.3恒温水浴锅。 4.4凝胶成像系统。 5PCR扩增仪。 4.5 4.6 5水平电泳槽。 4.7 微量移液器（量程：0.5μL10μL；2μL20μL：20μL~200μL;100μL~1000μL)。 4.8 组织匀浆器。 5 试剂和材料 5.1引物 上游引物：5'-GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA-3 下游引物：5-TGTGTTAGTGACTTTTGCCACC-3' 5.2猪肺炎支原体阳性对照样品及阴性对照样品 以灭活前浓度为1X10°CCU/mL~1×10CCU/mL的猪肺炎支原体菌液培养物（由指定单位提 供），经PCR检测不含猪絮状支原体、猪滑液支原体和猪鼻支原体后作为阳性对照样品，以无菌双蒸水 作为阴性对照样品。 5.3 3试剂 5.3.1 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。 5.3.2 Taq 酶。 5.3.3 PCR反应缓冲液（与Taq酶匹配）。 5.3.4 氯化镁（MgCl²，25mmol/L）。 5.3.5 dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP,各 2.5 mmol/L)。 5.3.6 酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25：24：1）。 5.3.7 三氯甲烷。 5.3.8 异丙醇（一20℃预冷）。 5.3.9 琼脂糖。 5.3.10 DNA相对分子质量标准MarkerDL2000。 5.3.11 0.01mol/LPBS液(pH7.2~pH7.4)(配制方法见附录A)。 5.3.12 DNA提取液（配制方法见附录A）。 5.3.13 75%乙醇（配制方法见附录A）。 5.3.14 TE溶液（pH8.0)（配制方法见附录A）。 5.3.15 电泳缓冲液（1XTBE或1XTAE)（配制方法见附录A）。 5.3.16 溴化乙锭溶液（10mg/mL）（配制方法见附录A）。 5.3.17 上样缓冲液（配制方法见附录A）。 2 GB/T35909—2018 6操作程序 6.1# 样品采集、运输、处理和检测的生物安全要求 有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。 6.2样品采集和运输 6.2.1新鲜肺组织样品采集和运输 剖检未腐败病死猪或发病猪，采集具有特征病变与正常组织连接处的肺组织0.5g～1.0g，置于无 菌密封袋或密封容器中，于2℃～8℃下24h内完成运送工作。如样品不能被及时送到实验室，应置 于一20℃以下保存。 6.2.2支气管肺泡灌洗液采集和运输 采集新鲜解部的未破损的猪肺脏，气管注入50mL～~100mL灭菌的0.01mol/LPBS（pH7.2~ pH7.4）溶液，轻探肺脏3min~5min，转移5mL~10mL灌洗液至无菌容器中，运输与保存方法同 6.2.1。 6.2.3鼻拭子采集和运输 采样人员将猪保定后，用棉拭子轻轻插人鼻腔，稍作拐弯，绕过骨状瓣膜，与鼻中隔平行方向插入约 PBS溶液的灭菌离心管中，运输与保存方法同6.2.1。 6.3样品处理与DNA提取 6.3.1肺组织的处理与DNA提取 取0.5g~1.0g肺组织样品，加入5mL0.01mol/LPBS溶液后，充分匀浆，制成0.1g/mL~0.2g/ml 500μL，振荡混匀，12000r/min离心5min，吸取上清液加人等体积的三氯甲烷，振荡混匀，12000r/min 离心5min，吸取500μL上清液与400μL的异丙醇充分混合，12000r/min离心5min，75%乙醇洗涤 沉淀一次，12000r/min离心5min，弃上清，沉淀干燥后溶于30μLTE溶液中，即可用于检测或保存 于-20℃。 6.3.2支气管肺泡灌洗液的处理与DNA提取 SZG 取5mL～10mL支气管肺泡灌洗液，12000r/min离心20min，弃去上清，沉淀用200μL 0.01mol/LPBS溶液重悬后，加人750μLDNA提取液提取DNA，方法同6.3.1。 也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。 6.3.3鼻拭子样品的处理与DNA提取 采用水煮法提取待检猪鼻拭子样品DNA。将浸有鼻拭子的离心管振荡5s，2℃～8℃放置2h，用 3 GB/T35909—2018 6.3.4培养物和阳性对照样品的处理与DNA提取 20min，弃去上清。其DNA提取的操作方法同6.3.3。 6.4PCR反应 6.4.1PCR反应体系 10XPCR反应缓冲液2.5μL、dNTPs（10mmol/L)2μL、氯化镁（25mmol/L)2μL、引物（10μmol/L） 各0.5μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL、模板DNA2μL～5μL，用灭菌的双蒸水补足反应体积至 25μL。 也可使用等效商品化PCR反应预混液， 6.4.2PCR反应程序 95℃预变性12min后进人PCR循环；94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸40s，进行30个 循环；最后72℃延伸7min；2℃~8℃保存反应产物。 6.4.3PCR产物电泳 PCR扩增产物与上样缓冲液按5：1比例混合，加样于已制备好的1%琼脂糖凝胶中（见附录A）， 同时分别加MarkerDL2000（0bp～2000bp）、阴性对照和阳性对照，100V~～120V恒压电泳20min~ 40min，凝胶成像系统观察并记录结果 6.5 结果判定 6.5.1试验成立判定 若阳性对照样品出现649bp的目标扩增条带，同时阴性对照样品无目标扩增条带，则试验成立（参 见C.1）。否则试验不成立。 6.5.2检测结果判定 检样品未出现649bp目的条带，则判定为猪肺炎支原体核酸阴性； 若进一步验证，可对PCR扩增产物进行测序，其目标序列参见C.2。 4 GB/T359092018 附录A （规范性附录） 溶液的配制 A.1 0.01mol/L PBS溶液(pH7.2~pH 7.4) 准确称量下面各试剂，加人到800mL蒸馏水中溶解，调节溶液的pH至7.2~7.4，加水定容至1L。 分装后在121℃灭菌15min～20min，或过滤除菌，保存于室温 8.00 g 氯化钠（NaCI） 氯化钾(KCI) 0.20 g 磷酸二氢钾（KH,PO） 0.24 g 磷酸氢二钠(NazHPO,·12H,O) 3.65 g 蒸馏水 加至1000mL A.1电泳缓冲液的配制（1×TAE或1×TBE A.1.10.5mol/LEDTA(pH8.0)的配制 称取NaEDTA·2H2O18.61g，用80mL蒸留水