ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35911—2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of pseudorabies virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35911—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司。 本标准主要起草人：张强、童光志、李健、熊炜、赵和平、李树清、王艳、李国新、杨忠苹、花群义、林颖峰、 王巧全、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅。 1 GB/T 35911—2018 伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了伪狂犬病病毒荧光PCR检测的操作方法 本标准适用于伪狂犬病病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光PCR荧光聚合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction） Ct值每个反应管内的荧光信号量达到设定的值时所经历的循环数（cyclethreshold） DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) Taq 酶 Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) TE缓冲液 Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer) PRV 伪狂犬病病毒（pseudorabiesvirus） 4 仪器 4.1 荧光PCR检测仪。 4.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 组织研磨器或者研钵。 4.4 普通冰箱：2℃~8℃。 4.5 普通冰柜：一20℃以下 超低温冰箱：可控温至一70℃以下。 4.7 配备与移液器匹配的吸头 4.8 高压灭菌锅。 5 耗材 5.11.5mL离心管 5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。 1 GB/T35911—2018 6试剂 6.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。 6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2℃～8℃保存。 6.3无水乙醇，一20℃预冷 6.58mmol/LNaOH溶液，配制见附录A。 6.6PBS缓冲液，配制见附录A。 6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/uL,Taq酶反应缓冲液中Mg+浓度 为15mmol/L。 6.8dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存，避免反复冻融 6.9引物和TaqMan探针，其序列见附录B。 6.10伪狂犬病病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒， 一20℃保存备用；阴性对照可采用健康猪的组织材料。 6.11内参照质粒：带有人β-珠蛋白基因的质粒。 7样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。 7.1.2 一次性无菌采样拭子。 7.1.3组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h。 7.1.4真空采血管。 7.2样品采集 7.2.1血液样品采集：用无菌注射器采集血液，注含1/104%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀， 编号备用 7.2.2精液样品采集：按照GB/T25172的方法采集和保存精液。 7.2.3鼻子采集：用棉子取受检动物鼻腔分泌物，置于2mLPBS缓冲液中备用。 7.2.4组织样品采集：取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组织，置 于无菌离心管内，编号备用。 7.2.5细胞培养物：细胞培养物反复冻融三次，第3次解冻后，将细胞培养物置于1.5mL无DNA酶 的灭菌离心管内，编号备用。 7.3 3样品保存和运输 一20℃土5℃下应不超过3个月，一70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规 定温度下的保存期内送达。 7.4样品处理 7.4.1血液和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。 2 GB/T 35911—2018 5min，取上清后用于后续的核酸提取。 7.4.3组织样品：取1g解冻的组织，剪碎，加人2mLPBS缓冲液进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离 心5min，取上清用于后续的核酸提取。 7.4.4细胞培养物：4.000r/min，4℃离心10min，取上清用于后续的核酸提取。 8荧光PCR操作程序 8.1DNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒提取。 8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照，对每个离心管进 行编号。 8.1.3每管先加人800μLDNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒10次混 匀，4℃或室温10000r/min离心10min。 8.1.4取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加人500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min； 4℃或室温10000r/min离心5min。 8.1.5弃上清，沿管壁缓缓加入0.8mL~1mL75%乙醇，颠倒3次~6次混勺，4℃10000r/min离心 5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液 8.1.6用30μuL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，DNA在2℃～8℃冰箱可保存两个月，一20℃冰柜 可稳定保存两年。 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n，n为待检样品数十阳性管数十阴性管数，每 个反应的体系见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒 中进行。 8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管39.8L分装于0.2mL透明PCR管内，将 PCR管置于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。 8.2.3加样 在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加人0.2μL的内参照质粒，并分别加人8.1制备的核酸 10μLDNA溶液，盖上盖子，500r/min1000r/min离心30s。转移至检测区。 8.2.4上机检测 8.2.4.1荧光通道设置 在检测区进行。将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，设置探针：5°选择FAM、 HEX和ROX三个荧光通道，3均选择无（None）荧光 8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段，预反应50℃/2min； 第二阶段，预变性95℃/2min； 3 GB/T35911—2018 第三阶段，变性95℃/15s，退火、延伸、荧光采集60℃/30s，40个循环； 第四阶段，冷却25℃/10s。 检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。 9结果判定 9.1 闵值设定 國值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以國值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准 9.2质量控制 9.2.1PRV阴性对照：FAM通道无报告Ct值或无典型的S型扩增曲线，HEX通道无报告Ct值或无 典型的S型扩增曲线，ROX通道Ct值≤36且扩增曲线为典型的S型。 的扩增曲线均为典型的S型。 9.2.3以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。 9.3结果描述及判定 9.3.1被检样本检测结果中FAM通道Ct值≤38,HEX通道Ct值<38，且扩增曲线均为典型的S曲 线，报告为PRV核酸阳性；38<Ct值≤40，判定为可疑，可疑样品须重复检测。如重复后仍然38<Ct 值≤40，且扩增曲线均为典型的S曲线，报告为PRV核酸阳性 Ct值或者无典型的S型扩增曲线，报告为PRVgE缺失株核酸阳性。 9.3.3被检样本检测结果中FAM通道和HEX通道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线，同时ROX 通道Ct值<36且扩增曲线为典型的S曲线，则该样本超过本方法检测灵敏度范围，报告为PRV核酸 阴性。 9.3.4被检样本检测结果中FAM通道和HEX通道均无Ct值或无典型的S型扩增曲线，同时ROX 通道Ct值>36，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。 4 GB/T 35911—2018 附录A （规范性附录） 溶液配制 A.18 mmol/L NaOH溶液 称量0.32gNaOH，溶解到1000mL去离子水中，混匀，分装，常温保存。 A.2 磷酸盐缓冲液（0.01mol/LPBS.pH7.4） 用800mL蒸馏水溶解8gNaCl,0.2gKCl,1.44gNa2HPO,和0.24gKH2PO。用HCI调节溶 液的pH至7.4，加水至1L。分装后经121℃、15min高压灭菌后备用。 5