ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T14700—2018 代替GB/T14700—2002 饲料中维生素B1的测定 Determination of thiamine in feed 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 14700—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T14700—2002《饲料中维生素BI的测定》。 本标准与GB/T14700一2002相比，主要技术变化如下： 修改了适用范围（见第1章，2002年版的第1章）； 一删去了硫胺素的分子式（见第3章，2002年版的3.1）； 酸性20%乙醇溶液的制备给出具体配置过程（见第3章，2002年版的3.2）； 一样品制备中规定添加剂预混合饲料不粉碎（见第4章，2002年版的4.4）； 复合预混合饲料提取液区别于维生素预混合饲料，改为酸性氯化铵甲醇溶液（见第4章，2002 年版的4.2.9）； 增加了维生素B的色谱图和光谱图（见附录A)。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 （北京）。 本标准主要起草人：李兰、贾铮、樊霞。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T147001999.GB/T147002002 1 GB/T14700—2018 饲料中维生素B，的测定 1范围 本标准规定了用荧光分光光度法和高效液相色谱法测定饲料中维生素B，含量的两种方法。 本标准方法1适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中的维生素B的测定。方法的定量限为 1mg/kg（在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质存在的情况，本方法不适用）。该方法所测定的 维生素B，包括内源性以及添加量总和。 本标准规定的方法2适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料的测定。方法2的检出限为 3mg/kg；定量限为15mg/kg。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3方法1:荧光分光光度法 G 3.1原理 试样中的维生素B经稀酸以及消化酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件下被铁氰化钾 氧化生成荧光色素-硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素B的含量 成正比，依此进行定量测定。 3.2试剂或溶液 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，色谱用水应满足GB/T6682中一级水的要求；实验用 水应满足GB/T6682中三级水的要求 3.2.1盐酸溶液c（HCI)=0.1mol/L。 3.2.2硫酸溶液c(1/2HzSO,)=0.05mol/L。 3.2.3乙酸钠溶液 c(CH,COONa)=2.0 mol/L。 3.2.4100g/L淀粉酶悬乳液：用乙酸钠溶液（3.2.3）悬浮10g淀粉酶制剂，稀释至100mL，使用当日 制备。 3.2.5 氯化钾溶液：250g/L。 3.2.6 酸性氯化钾溶液：将8.5mL浓盐酸加入至氯化钾溶液（3.2.5）中，并稀释至1000mL。 3.2.7 氢氧化钠溶液：150g/L。 3.2.8铁氰化钾溶液：10g/L。 100mL，此液4h内使用。 1 GB/T14700—2018 3.2.10冰乙酸溶液：30mL/L。 3.2.11酸性20%乙醇溶液：取80mL水，用盐酸溶液（3.2.1）调节pH3.5~4.3，与20mL无水乙醇 混合。 3.2.12人造沸石[0.25mm～0.18mm（60目~80目）]：使用前应活化，方法如下：将适量人造沸石置 于大烧杯中，加入10倍容积，加热到60℃～70℃的冰乙酸溶液（3.2.10），用玻璃棒均匀搅动10min，使 沸石在冰乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层冰乙酸液，重复上述操作2次。换用5倍容积，加热 到60℃～~70℃的氯化钾溶液（3.2.5）搅动清洗2次，每次15min。再用热冰乙酸溶液洗10min。最后 用热水清洗沸石至无氯离子（用10g/L硝酸银水溶液检验）。用布氏漏斗抽滤，105℃烘干，于磨口 瓶可使用6个月。 使用前，检查沸石对维生素B标准溶液的回收率，如达不到92%，应重新活化沸石。 注：沸石对维生素B回收率的检查：移取维生素B标准中间液（3.2.13.2)2mL用酸性氯化钾溶液（3.2.6)定容至 100mL。按照3.5.4.1～3.5.4.3步骤进行氧化，作为外标。另一份维生素B标准工作液（3.2.13.3）移取25mL 重复3.5.3.1～3.5.3.3过柱操作，按照3.5.4.1～3.5.4.3步骤进行氧化。同时测定两份溶液荧光强度，依照式（1） 计算，经换算为百分数就是沸石对维生素B的回收率值。 3.2.13维生素B标准溶液 3.2.13.1维生素B标准贮备液：取硝酸硫胺素标准品（纯度大于99%），于五氧化二磷干燥器中干燥 24h。称取0.01g（精确至0.0001g），溶解于酸性20%乙醇溶液（3.2.11）中并定容至100mL，盛于棕色 瓶中，2℃～8℃冰箱保存，可使用3个月。该溶液含0.1mg/mL维生素Bl。 3.2.13.2维生素B，标准中间液：取维生素B标准贮备液（3.2.13.1)10mL用酸性20%乙醇溶液（3.2. 11)定容至100mL，盛于棕色瓶中，2℃～8℃冰箱保存，可使用48h。该溶液含10μg/mL维生素B。 3.2.13.3维生素B，标准工作液：取维生素B标准中间液（3.2.13.2)2mL与65mL盐酸溶液（3.2.1） 和5mL乙酸钠溶液（3.2.3）混合，定容至100mL，分析前制备。该溶液含0.2μg/mL维生素Bl。 3.2.14硫酸奎宁溶液 3.2.14.1硫酸奎宁贮备液：称取硫酸奎宁0.1g（精确至0.001g）用硫酸溶液（3.2.2）溶解并定容至 1000mL。贮于棕色瓶中，冷藏。若溶液混浊则需要重新配制。 3.2.14.2硫酸奎宁工作液：取贮备液（3.2.13.1)3mL，用硫酸溶液（3.2.2）定容至1000mL。于棕色 瓶中，冷藏。该溶液含0.3μg/mL硫酸奎宁 3.2.15正丁醇：荧光强度不超过硫酸奎宁工作液（3.2.14.2）的4%，否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取 114℃~118℃馏分。 3.3仪器设备 3.3.1 实验室常用玻璃器血。 3.3.2 分析天平：感量0.0001g.0.001g。 3.3.3高压釜，使用温度为121℃123℃或压力达到15kg/cm。 3.3.4电热恒温箱，45℃~50℃。 3.3.5吸附分离柱：全长235mm，外径×长度如下：上端贮液槽尺寸为35mm×70mm，容量约为 50mL，中部吸附管8mm×130mm；下端35mm拉成毛细管。 3.3.6具塞离心管25mL。 3.3.7荧光分光光度计，备1cm石英比色杯。 3.3.8注射器：10mL。 3.4样品 按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195制备试样，粉 2 GB/T14700—2018 碎过0.425mm孔径筛，充分混匀。 3.5试验步骤 3.5.1称样 称取原料、配合饲料、浓缩饲料1g~2g，精确至0.001g，置于100mL棕色锥形瓶中。 3.5.2试样溶液的制备 3.5.2.1水解：加人盐酸溶液（3.2.1)65mL于锥形瓶中，加塞后置于沸水浴加热30min[或于高压釜 （3.3.2）中加热30min」，开始加热5min~10min内不时摇动锥形瓶，以防结块 3.5.2.2酶解：冷却锥形瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶悬浮液（3.2.4)，摇匀。该溶液pH约为4.0～ 4.5，将锥形瓶至于电热恒温箱（3.3.4)中45℃～50℃保温3h，取出冷却，用盐酸溶液（3.2.1)调整pH 至3.5，转移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至100mL，摇匀。 3.5.2.3过滤：将全部试液通过无灰滤纸过滤，弃去初滤液5mL，收集滤液作为试样溶液。 3.5.3试样溶液的纯化 （3.2.10）浸泡，溶液液面没过沸石即可。将脱脂棉置于吸附分离柱（3.3.5)底部，用玻璃棒轻压。然后将 乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脱水），过柱流速控制在1mL/min为宜。再用10mL近沸 的水洗柱1次。 3.5.3.2吸取25mL试样溶液（3.5.2.3），慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5mL近沸的 水洗柱3次，弃去洗液。同时做平行样。 3.5.3.3用25mL60℃～70℃酸性氯化钾溶液（3.2.6）分3次连续加人吸附柱，收集洗脱液于25mL 容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾溶液定容，混匀 3.5.3.4同时用25mL维生素B标准工作液（3.2.13.3）。重复3.5.3.1～3.5.3.3操作，作为外标。 3.5.4氧化与萃取 警示一一以下操作避光进行。 3.5.4.1于2只具塞离心管（3.3.6）中各吸人5mL洗脱液（3.5.3.3），分别标记为A、B 3.5.4.2在B管加入3mL氢氧化钠溶液（3.2.7），再向A管中加3mL碱性铁氰化钾溶液（3.2.9）,轻轻 旋摇。依次立即向A管加入15mL正丁醇（3.2.15）加塞，剧烈振摇15s，再向B管加人15mL正丁醇 加塞，共同振摇90s，静置分