ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35806—2018 动物流感检测 H7N9亚型流感病毒 双重荧光RT-PCR检测方法 Animal influenza detectionProtocol of duplex real-time RT-PCR for influenza virus subtypes H7 and N9 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35806—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国出人境检验检疫协会、中国农业 科学院哈尔滨兽医研究所，中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：蒲静、高志强、汪琳、乔彩霞、张锡全、周琦、张鹤晓、张伟、尹羿、柏亚铎、刘艳华 刘环、王秀荣、包红梅、韩雪清、王慧煜 GB/T 35806—2018 动物流感检测H7N9亚型流感病毒 双重荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了同时检测H7和N9亚型动物流感病毒核酸的TaqMan双重荧光RT-PCR操作 方法。 本标准适用于H7和N9亚型动物流感病毒核酸的快速检测和筛查。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19438.1一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct（或Cp）值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（ThresholdCycle，or Crossing Point) DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate） FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein） HA:血凝素(Hemagglutinin) HEX：六氯-6-甲基荧光素（Hexachlorofluorescein） MGB：小沟结合物（MinorGrooveBinder） NA：神经氨酸酶（Neuraminidase） TAMRA：羧基四甲基罗丹明（Carboxytetramethylrhodamine) 荧光RT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR） 4试剂和材料 4.1试剂 4.1.1总则：除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。 4.1.2TRIzol:2℃~25℃保存。 4.1.3氯仿：2℃~8℃预冷。 4.1.4异丙醇：-20℃预冷。 4.1.5 DEPC水：配方见A.1。 1 GB/T358062018 4.1.7 PBS（含青霉素和链霉素）：配方见A.2。 4.1.8H7和N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测引物、探针序列，反应液配方见附录B。 4.1.9阳性、阴性对照 阳性对照：为灭活的H7N9亚型流感病毒液或体外转录的H7和N9cRNA。 阴性对照：为已知流感病毒阴性的动物组织悬液， 仪器设备 4.2 4.2.1 荧光PCR检测仪及配套反应管（板）。 4.2.2 高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12000r/min）。 4.2.3台式离心机。 4.2.4振荡器。 4.2.5 组织匀浆器。 4.2.6 冰箱（2℃~8℃和一20℃两种）。 4.2.7 微量移液器（5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头。 4.2.81.5mL离心管（无核酸酶）和5mL采样管。 5实验室的标准化设置与生物安全管理 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1一2004中的附录C；实验室生物安全管理见 GB 19489。 6样品的采集与前处理 6.1总则 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，注意无菌操作。 6.2采样工具 6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、商品化一次性采样袋 6.2.2除商品化棉拭子、采样袋外，上述采样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干或经 160℃干烤2h。 6.3样品采集 6.3.1 拭子样品 根据动物种类，可采集咽喉拭子，泄殖腔拭子（禽）或鼻拭子（猪等其他动物）。采集方法如下： 取咽喉拭子时将拭子深人喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液； 取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； 取鼻子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物 将采样后的拭子放人盛有2.0mLPBS（含青霉素和链霉素）的采样管中，编号。 6.3.2组织样品 病死禽采集肺脏或气管分泌物等组织；其他动物用无菌剪、镊采集肺脏等组织脏器，装人无菌采样 2