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ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35336—2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Apple fruit crinkle viroid 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35336—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:邓丛良、赵晓丽、吕玉峰、梁新苗、骆卫峰、郑春生、张永江。 GB/T35336-—2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了苹果皱果类病毒的检疫鉴定方法, 本标准适用于可能带有苹果皱果类病毒的植物材料的检测鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3苹果皱果类病毒基本信息 学名:Apple fruit crinkle viroid。 缩写:AFCVd。 分类地位:马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae)、苹果锈果类病毒属(Apscaviroid)。 苹果皱果类病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 类病毒检测主要针对其核酸序列。主要的方法有RT-PCR和核酸分子杂交 5仪器设备、主要用具和主要试剂 5 5.1仪器设备 电子天平(感量0.001g)、普通天平(感量0.1g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超 低温冰箱(一80℃)、制冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、PCR仪、微波炉、电泳仪、电 泳槽、凝胶分析成像系统、实时荧光PCR仪、杂交炉、塑料薄膜封口机、紫外交联仪、暗箱、摇床、恒温水 浴锅、组织破碎仪等。 5.2 2主要用具 可调移液器(2.5L、10μL、20uL、200μL、1000uL、5000uL)、无RNA酶吸头(10uL20uL 反应管(200uL)、实时荧光96孔反应板、杂交瓶、杂交膜、杂交袋、X光片。 5.3主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。RT-PCR检测试 剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C;斑点杂交检测试剂见附录D。 1 GB/T353362017 6检测与鉴定 6.1 普通RT-PCR检测方法 普通RT-PCR检测方法见附录B。 6.2 实时荧光RT-PCR检测方法 实时荧光RT-PCR检测方法见附录C。 6.3 斑点杂交检测方法 斑点杂交检测方法见附录D。 7结果判定 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且实时荧光RT-PCR检测为阳性或斑点杂交检测为阳性,则判 定为检出苹果皱果类病毒。 样品经普通RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致,则判定为检出苹果 皱果类病毒 样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性,且序列测定结果与已知的AFCVd序列一致,则判定为检出 苹果皱果类病毒。 样品保存与结果记录 8 8.1 样品保存 样品经登记人和经手人签字后妥善保存3个月,种子保存在4℃冰箱内,生长苗木或插条保存在隔 6个月,以备复核、谈判和仲裁。保存期满后,应灭活处理。 8.2 结果记录 完整的实验记录要包括样品的来源、种类、采集时间、实验检测时间、地点、方法和结果,并有实验人 员的签字,普通RT-PCR检测结果保存电泳照片,实时荧光RT-PCR检测结果保存荧光曲线图及Ct 值,斑点杂交检测保存照片,序列测定结果保存测序报告图。 2
GB-T 35336-2017 苹果皱果类病毒检疫鉴定方法
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