ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 35331—2017 番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Didymella lycopersici Klebahn 2018-07-01实施 2017-12-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35331—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：崔铁军、罗加凤、陈定虎、刘跃庭、黄国明、杨韶勇。 GB/T35331—2017 番茄亚隔抱壳茎腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了番茄亚隔孢壳茎腐病菌的检疫鉴定方法， 本标准适用于番茄及其他番茄亚隔孢壳茎腐病菌寄主种子、植株、果实中番茄亚隔孢壳茎腐病菌的 检疫鉴定。 2番茄亚隔孢壳茎腐病菌的基本信息 中文名：番茄亚隔孢壳茎腐病菌 学名：Didymella lycopersici Klebahn. 无性世代学名：PhomalycopersiciCooke. 异名：Boeremialycopersici（Cooke)Aveskamp，Gruyter&Verkley. Ascochyta lycopersici (Plowr.)Brunaud. Diplodina lycopersici Hollos. 英文名:ascochyta blight, fruit rot of tomato, leaf spot of tomato, stem canker of tomato, stem rotof tomato 分类地位：番茄亚隔孢壳茎腐病菌属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizo 双胞腔菌属（Didymella）。无性世代PhomalycopersiciCooke，属腔孢纲（Coelomycetes），球壳孢目 （Sphaeropsidales），茎点霉属（Phoma）。 传播途径：病菌依靠带菌种子及病残体远距离传播。 番茄亚隔孢壳茎腐病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 病原菌为害症状、培养性状、形态特征、致病性测定及代谢产物Antibiotic“E”的测定结果作为番茄 亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定的依据。 4 仪器用具和主要试剂 4.1仪器用具 4.1.1仪器 体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20℃）。 4.1.2用具 培养皿（直径90mm）、白瓷盘、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、一次性注射器（1mL）、棉纱、 脱脂棉、酒精灯、离心管（2mL）。 1 GB/T35331—2017 4.2主要试剂 葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、燕麦片、麦芽膏、无水乙醇、1.0%次氯酸钠（NaCIO）、0.1%氢氧化 钠（NaOH)。 马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA、麦芽提取物培养基MEA、燕麦培养基OA，培养基制备方法参 见附录B。 5病菌的鉴定 5.1疑似材料挑选 5.1.1种子中疑似材料挑选 将待检样品倒入洁净白瓷盘内，挑选干瘾、弱小、畸形的可疑病种子和植株残体作为实验材料，植株 残体包括枝、叶、叶柄等。 5.1.2植株疑似材料挑选 取待检植株，仔细观察植株枝、叶、果实上病菌为害症状（参见A.4、图A.1），枝条基部是否有黑褐 有病菌的子实体（分生孢子器），发现病菌子实体的，直接用灭菌的挑针或牙签挑取，制片镜检，显微镜下 观察分生孢子器、分生孢子的形态特征。可疑的枝、叶、果实材料立即进行病菌分离培养。 5.2分离培养 5.2.1实验材料前处理 疑似材料为植株的枝、叶，用自来水充分冲洗，取病健交界组织，剪成约0.4cm×0.4cm小块，用 0.5%的次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后培养；疑似材料为果实，果实病 健交界处组织用75%乙醇擦拭表面消毒，再用灭菌针挑取小块组织进行培养。 种子中挑选出的植株残体和可疑种子分别用纱布包好，放人0.5%的次氯酸钠溶液中，消毒5min， 灭菌水冲洗3次，种子于无菌条件下22℃保湿24h，再置于一20℃下冰冻24h后培养，经表面消毒后 的植株残体，用灭菌滤纸吸干水分后直接培养。 5.2.2病菌分离培养 前处理后的实验材料置马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA平板上，每血放置4粒5粒或4块~～ 5块，18℃～20℃，12h光照黑暗交替培养。培养3d后开始观察，发现乳白色或白色可疑菌落，立即 用PDA、MEA、OA培养基分离纯化，7d后记录菌落培养性状，包括菌落生长速度、颜色，形状等，体视 显微镜下观测分生孢子器产生情况，生物学显微镜下测定分生孢子器、分生孢子形态特征及大小，对菌 落性状及病菌形态特征拍照留存。 5.3致病性测定 灭菌土中种植番茄，幼苗高15cm，约6片～8片叶时接种。待测菌株PDA上培养10d后，取菌落 中分生孢子黏液制成孢子悬浮液（孢子适宜浓度为1X10°CFU/mL），选用健壮番茄幼苗，茎杆用75% 乙醇表面消毒，无菌水冲洗3次，吸干水分，分生孢子悬浮液针刺接种，用湿润脱脂棉覆盖接种部位，以 无菌水接种为对照，接种后放人18℃20℃培养箱内保湿黑暗培养，2d后移去脱脂棉，12h光照黑暗 交替继续保湿培养。 2