ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35329—2017 首疫霉根腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phytophthora medicaginis E.M. Hans. et D.P. Maxwell 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35329—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张裕君、杜洪忠、郭京泽、贺艳、刘鹏、刘跃庭、吴品珊。 GB/T353292017 首疫霉根腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了首猎疫霉根腐病菌的检疫鉴定方法 本标准适用于针对首疫霉根腐病菌寄主（参见附录A）的植物、植物产品以及夹带土壤和介质中 的首着疫霉根腐病菌的检疫和鉴定 首疫霉根腐病菌基本信息 学名:Phytophthora medicaginis E.M,Hans.et D.P.Maxwell。 分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），霜霉纲（Peronosporea），霜霉目（Peronospora les)，霜霉科(Peronosporaceae)，疫霉属（Phytophthora）。 传播途径：土壤，流水，栽培介质，幼苗，根部组织均能带菌、传播，贸易调运的干首猪草也有远距离 传播的风险。 首猪疫霉根腐病菌的其他信息参见附录A 3方法原理 寄主植物发病症状、病原菌的形态学特征和病原菌基因组目标片段的序列特征为鉴定依据样品 采集。 4仪器和用具 4.1仪器 超净工作台，光照培养箱，人工气候箱，生物显微镜，电子天平（感量0.01g），高压灭菌锅，血球计数 器，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，制冰机，分光光度计，PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像系统，荧光PCR 扩增仪。 4.2用具 烧杯，三角瓶，量筒，培养皿，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研杆，移液 器，移液器吸头，离心管。 试剂和培养基 C 5.1试剂材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。匹马霉素（C3:H7NOi:），氨苄青霉素钠盐（CiHisN;O,SNa)， 利福平钠盐（C43Hs8N.O12），五氯硝基苯（CC15NO2），碳酸钙（CaCO3）次氯酸钠（NaOCI） 1 GB/T35329—2017 氢氧化钠（NaOH），十六烷基三甲基溴化铵（CigH4zBrN），电泳缓冲液（1XTAE），无水乙醇 (C,H,OH)，异丙醇[CH,CH(OH)CH」，三氯甲烷（CHCl,），异戊醇（C,H12O)，琼脂糖,PCR缓冲液， TagDNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），1oobp DNA分子量 Marker,PCR 引物PmF和PmR，实时荧光PCR引物P990-F、P1050-R和探针P1010-Pr。 琼脂粉，V8汁。 5.2培养基 V8培养基：100mL过滤后的V8液，加人2.5gCaCO:（碳酸钙），17g琼脂粉，蒸馏水800mL，搅 拌混匀，定容至1000mL，121℃，灭菌30min，制备培养基平板备用。 选择性培养基PARP-V8:50mL过滤后的V8液，17g琼脂粉，800mL蒸馏水，定容至1000mL， 0.01g，五氯硝基苯0.05g，搅拌混匀，制备培养基平板备用。 6实验室检验 6.1症状检查 对于植株样品，重点观察根部有无变色、病斑，植株有无枝条枯萎、顶梢死亡等；如植物携带有土壤 6.2分离培养和诱集 6.2.1组织分离培养 新鲜植物根、茎组织在流水下冲洗1h～2h，在病健交界处或变色部位切取边长为5mm～10mm 3次，灭菌滤纸吸干水分，放于V8或选择性培养基PARP-V8上。 干首猪草用无菌水喷洒，在无菌培养血中保湿8h～12h，无菌水冲洗3次，火菌滤纸吸干水分，放 于V8或选择性培养基上。 培养皿25℃黑暗培养4d6d后，组织周围培养基上长出稀疏菌落，挑取菌落边缘菌丝块转人V8 培养基纯化，25℃黑暗培养。 6.2.2土壤和介质诱集 称量土块或介质25g，碾碎放人500mL灭菌洁净烧杯中。每份样品加灭菌蒸馏水，水面距土表 4.0cm左右，然后加人10片左右直径8mm～10mm的健康首种子长出的子叶或未成熟苹果的小切 片，切片大小以漂浮在水面为宜，封口膜封口保湿，25℃黑暗条件下放置3d～5d。 6.2.3诱集检查和培养 诱集3d～5d后，观察首宿叶片或苹果切片附近是否有棕色病变区，从变色的病健交界处取 25℃黑暗培养。 7PCR检测 7.1DNA提取 2