ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T15805.2—2017 代替GB/T15805.2—2008 传染性造血器官坏死病诊断规程 Diagnosis of infectious haematopoietic necrosis 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T15805.2—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准代替GB/T15805.2一2008《鱼类检疫方法第2部分：传染性造血器官坏死病毒 （IHNV）》。本标准与GB/T15805.2—2008相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 修改了标准名称； 增加了缩略语（见第3章）； 一删除了PCR扩增IHNV786bp、套式PCR扩增IHNV323bp方法（见2008年版3.7）； -增加了扩增IHNV693bp的方法（见4.10）； 增加了酶联免疫吸附试验（见8.3）； 增加了间接免疫荧光抗体试验（见8.4）； 一增加了综合判定（见第9章）； 增加了传染性造血器官坏死病（IHN）（见附录C）。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：浙江省宁波市海洋与渔业研究院、深圳市检验检疫科学研究院、全国水产技术推 广总站、北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：王建平、沈伟良、高隆英、张利峰、吴雄飞、江育林、陈爱平、乐韵。 本标准代替GB/T15805.2—2008。 本标准所代替标准历次版本发布情况为： GB/T15805.1—1995; GB/T15805.2—2008。 GB/T15805.2—2017 传染性造血器官坏死病诊断规程 1范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病毒经细胞分离培养后通过逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫 吸附试验和间接免疫荧光抗体试验鉴定的方法， 本标准适用于传染性造血器官坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect） ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） EPC:鲤上皮瘤细胞系（epitheliomapapulosumcyprinicellline） FCS:胎牛血清(fetal calf serum) FHM：胖头肌肉细胞系（fatheadmonnowcellline） G蛋白：糖蛋白（glycoprotein） HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl）piperazine-1-ethanesulfonicacid IFAT：间接免疫荧光抗体试验（indirectimmunofluorescentantibodytest) IHN：传染性造血器官坏死病（infectioushaematopoieticnecrosis） IHNV：传染性造血器官坏死病毒（infectioushaematopoieticnecrosisvirus) RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction) PBS：磷酸缓冲盐溶液（PhosphateBufferSaline） PBST：磷酸缓冲盐吐温溶液（PhosphateBufferSalin-Tween） PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） FITC:异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate) 4 试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水：GB/T6682中一级水，核酸抽提和RT-PCR应使用无RNA酶的去离子水。 4.2IHNV参考株：由国家主管部门指定机构提供。 1 GB/T15805.2—2017 4.3 鱼类细胞系：EPC、FHM 4.4 细胞生长液：用Earle's平衡盐的M199培养基配制，另加10%胎牛血清（FCS）。 4.5 5细胞维持液：用Earle’s平衡盐的M199培养基配制，另加2%FCS。 4.6细胞消化液：见A.1。 4.7HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）。 4.8 3Taq酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.9 dNTP：含dCTPdGTP、dATP,dTTP各1Ommol/L。 4.10引物：依据IHNV糖蛋白（G蛋白）基因片段序列设计引物，扩增其中693bp片段（参见附录B）。 正向引物F1:5'-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3'; 反向引物R2:5'-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3'。 4.11 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.12 AMV逆转录酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化 4.13 RNA酶抑制剂：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.14 逆转录酶缓冲液和Taq酶缓冲液：分别见A.2、A.3。 4.15 DNA分子量标准(DNAMarker)。 4.16 琼脂糖。 4.17 TBE电泳缓冲液：见A.4。 4.18 包被稀释液：0.02mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液（见A.5）。 4.19 羊抗IHNV免疫球蛋白（Ig）：由动物防疫管理部门指定单位提供。 4.20 鼠抗IHNV的单克隆抗体：由动物防疫管理部门指定单位提供 4.21 辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体 4.22 封闭液。 4.24 FITC标记的抗鼠抗体 4.25 样品缓冲液：见A.6。 4.26 氯化镁溶液：见A.7。 5 器材和设备 5.1 124孔、96孔细胞培养板、细胞培养瓶。 5.2 2倒置荧光显微镜。 5.3 3恒温培养箱。 5.4冰箱。 5.5 5微量可调移液器及吸头。 5.6 离心机和离心管。 5.7 7PCR扩增仪。 5.8 水平电泳仪。 5.9 紫外透射仪或凝胶成像仪。 5.10 高压灭菌锅。 5.11 水浴锅。 5.12 制冰机。 5.13 磁力搅拌器。 5.14 培养液过滤器。 5.15 酶标仪。 2