ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34745—2017 病毒 SYBR Green I 实时 猪圆环病毒2型 荧光定量PCR检测方法 Porcine circovirus type 2-Method of detecting virus by SYBR Green I real-time PCR 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34745—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：河南农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：魏战勇、郑兰兰、邵卫星、胡慧、陈红英、王亚宾、王学兵、崔保安、寇亚楠 1 GB/T34745—2017 猪圆环病毒 2 型 病毒 SYBR Green I 实时 荧光定量PCR检测方法 1范围 本标准规定了SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型的技术要求 本标准用于检测猪圆环病毒2型核酸，适用于临床样品中猪圆环病毒2型的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：循环阈值（CycleThreshold) DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid) EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid） PBS：磷酸盐缓冲溶液（PhosphateBufferSaline） PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） PCV2：猪圆环病毒2型（PorcineCircovirusType2） PMWS：仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome） Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase) tm值：解链温度（MeltingTemperature) 4试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压 灭菌)分装。 4.1蛋白酶K（配制见附录A）：20℃保存。 4.2裂解缓冲液（配制见附录A）：4℃保存。 4.3 异硫氰酸胍裂解液（配制见附录A）：4℃保存。 4.4 平衡酚（配制见附录A）：4℃保存。 酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混合液（配制见附录A）：4℃保存。 4.6 氯仿-异戊醇（24：1)（配制见附录A）：4℃保存。 4.7 氯仿：常温保存。 4.8 异丙醇：常温保存。 4.9 70%乙醇：用新开启的无水乙醇和灭菌去离子水配制（符合GB/T6682要求），一20℃预冷。 1 GB/T34745—2017 4.10SYBRGreenPreMix荧光染料预混酶：5U/uL，-20℃保存。 5 仪器设备 5.1 荧光定量PCR扩增仪 5.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 5.3组织研磨器或者研钵。 5.44℃冰箱、一20℃冰箱和-70℃以下超低温冰箱。 5.5可调微量移液器（2μL，10μL，100μL，200μL,1000μL）。 5.6振荡器。 5.7高压灭菌锅。 6耗材 6.1离心管（1.5mL）。 6.2 透明薄壁PCR管（0.2mL）。 7样品采集、运输及处理 7.1 样品采集 7.1.1采样工具 棉拭子、剪刀、镊子、1.5mL离心管、研钵。以上采样工具经121℃土2℃下15min高压灭菌，并干 燥处理。 7.1.2组织脏器 应采集疑似发病死猪的淋巴结、肺、脾、肝。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品，将采集的样品装人 一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，用冰盒装运送至实验室冻存备用。 7.1.3血清、血浆 用真空采血管或无菌注射器采集发病猪的血液，分离血清及血浆，并分装至无菌离心管中，密封，编 号后保存于4℃环境中送检。 7.2 样品运输 样品采集后，将采集的样品放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放人一个塑料袋内），存放于 含有冰袋的保温箱中、密封，送实验室。 7.3 组织样品处理 取待检样品2.0g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL灭菌生理盐水混匀，反复冻 融3次，3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。血清和血浆样品 可不经特殊处理，直接用于检测。 7.4样本存放 2 SAG