ICS 65.150 B 50 中华人民共和国国家标准 GB/T 34748—2017 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析 Genetic diversity analysis on aquatic germplasm by genomic DNA microsatellite markers 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34748—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会（SAC/TC156/SC1)归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。 本标准主要起草人：匡友谊、孙效文、郑先虎、梁利群。 GB/T 34748—2017 水产种质资源基因组DNA的微卫星分析 1范围 本标准规定了水产种质资源基因组DNA的微卫星分析的试剂与材料、仪器与设备、分析步骤及数 据分析。 本标准适用于水产种质资源基因组DNA的微卫星分析 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18654.15养殖鱼类种质检验第15部分：RAPD分析 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微卫星microsatellite SZIC 真核生物基因组中由两个或多个核苷酸重复排列形成的短串联重复序列。 3.2 微卫星分析 microsatelliteanalysis 用微卫星标记引物对基因组DNA进行扩增，扩增产物经凝胶电泳检测后，分析电泳图谱并计算其 中蕴涵的遗传多态性信息。 4 试剂与材料 除GB/T18654.15规定的试剂与材料外，以下试剂和材料是本标准所需的。除非另有说明，在分 析中仅使用确认为分析纯的试剂和双蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4.1去离子超纯水：须高压灭菌。 4.2 TEMED：于4℃冰箱中保存。 4.3 微卫星标记引物：配制方法符合附录A。 丙烯酰胺：DNA测序级。 4.5 甲叉双丙烯酰胺：DNA测序级。 4.6 尿素。 4.7 去离子甲酰胺。 4.8 聚丙烯酰胺凝胶存储液：配制方法符合附录A 10%（质量体积比）过硫酸铵（APS)溶液：配制方法符合附录A。 4.10 聚丙烯酰胺凝胶固定液：配制方法符合附录A。 4.11 聚丙烯酰胺凝胶染色液：配制方法符合附录A， 1 GB/T 34748—2017 4.12 聚丙烯酰胺凝胶显色液：配制方法符合附录A。 4.13电泳载样液：配制方法符合附录A。 4.14琴 基因组DNA提取试剂盒：从生物试剂供应商处购买 4.151XTrisEDTA（TE）：配制方法符合附录A。 5 仪器与设备 除GB/T18654.15规定的仪器与设备外，以下仪器与设备是本标准所需的。 5.1扫描仪或光密度扫描成像仪。 5.2垂直电泳槽1套。 5.3DNA测序电泳槽1套 5.4高压恒功率电泳仪1套。 5.5自动测序仪或遗传分析仪。 5.6水平转动脱色摇床。 6抽样 试验生物抽样按照GB/T18654.15的规定执行，样本量宜40个以上。 7分析步骤 7.1 基因组DNA提取 可用基因组DNA提取试剂盒或已被验证可以抽提到高质量基因组DNA的方法或按GB/T18654.15 的规定提取基因组DNA。若用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA按说明书操作。 7.2 2基因组DNA纯度及浓度测定 按GB/T18654.15的规定执行。 7.3 3微卫星标记的选择 从受检测物种或近缘种中筛选出扩增稳定、重复性好且具有多态性的微卫星标记用于基因组DNA 的微卫星分析。微卫星标记应遵循哈代温博格平衡，微卫星标记所含等位基因数宜在4个以上，微卫星 标记数量应遵循标记数量增加而有效等位基因、期望杂合度、多态性信息含量等不发生显著变化时最少 标记的数量，一般为25个～30个。 7.4基因组 DNA 的PCR扩增 7.4.1基因组DNA的准备 根据7.2基因组DNA纯度和浓度测定结果，取部分DNA用灭菌的超纯水稀释至50ng/uL，于 4℃中保存备用，其余放一20℃冰箱中保存。 7.4.2微卫星标记引物的准备 根据7.3的原则选择微卫星标记，将合成的引物配制成100μmol/μL的保存液，于一20℃冰箱中 保存备用。使用时取部分保存液，配制成10umol/μL使用液，也可按所需倍数稀释后使用，保存液仍 2