ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34739—2017 动物狂犬病病毒中和抗体检测技术 Detecting technique of neutralization antibody against rabies virus in animals 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34739—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准参考世界动物卫生组织（OIE)2013年版《国际陆生动物卫生法典》2.1.13狂犬病的相关 内容。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 本标准主要起草人：扈荣良、张守峰、刘哗、张菲。 1 GB/T34739—2017 动物狂犬病病毒中和抗体检测技术 1范围 本标准规定了用于动物狂犬病血清中和抗体定量测定的荧光抗体病毒中和试验（FAVN)的血清样 品采集、实验操作方法及结果判定。 本标准适用于动物个体狂犬病免疫效果的定量测定、群体免疫覆盖率监测及狂犬病流行风险评估 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法 GB19489—2008实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATV：抗生素-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（Antibiotic-Trypsin-Versene） BHK-21：乳仓鼠肾细胞系（BabyHamsterKidney-21) BSL-2：生物安全2级实验室（BiosafetyLaboratoryLevel2） CVS：狂犬病标准攻击毒株（ChallengeVirusStandard) FAVN：荧光抗体病毒中和试验（FluorescentAntibodyVirusNeutralizationTest) FITC：异硫氰酸荧光黄（FluoresceinIsothiocyanate） MEM:细胞基础培养基（Eagle'sMinimumEssentialMedium) PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-BufferedSaline） TCIDso：半数细胞感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose） 4 试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水：GB/T6682—2008，二级水。 4.2 商品化的狂犬病阴性标准犬血清。 4.3 商品化的狂犬病阳性标准犬血清，用前稀释至0.5IU/mL 4.4 FITC标记的抗狂犬病病毒抗体，用PBS(0.01mol/L，pH7.4，见A.1)稀释成工作液，现用现配 4.5 MEM(见 A.2)。 4.6 细胞培养用抗生素溶液（见A.3）。 抗生素-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ATV）溶液（见A.4）。 4.8 固定液：80%丙酮（见A.5）。 警示——丙酮易燃，有害健康。 1 GB/T34739—2017 4.9 BHK-21细胞。 4.10狂犬病标准攻击毒株CVS-11,滴度应≥10°TCIDso/mL 5器材和设备 5.2 296孔微量培养板。 5.337℃5%二氧化碳培养箱 5.4倒置荧光显微镜。 5.5普通冰箱和超低温冰箱。 5.6 细胞计数器。 5.720μL~200μL吸头。 5.8 3BSL-2级生物安全柜。 动物血清的采集 无菌采集动物血液不少于2mL，室温或37℃静置60min。4℃放置1h至过夜后，6000r/min离 心5min，收集上清，一20℃以下保存待检。样品采集应详细记录动物品系、大小、免疫史、芯片号码、主 人姓名等信息。 7FAVN实验操作 7.1安全防护 本检测应在满足GB19489—2008的BSL-2级生物安全实验室内进行。进行本检测的人员应采取 针对性防护措施（见附录B）。 7.2 2材料准备 7.2.1细胞 按常规方法培养BHK-21细胞，1个75cm²的细胞培养瓶（10mL培养液）细胞刚长成单层后 （4×10°细胞/mL），可以用于2块96孔（每孔细胞数为2×104个/孔）细胞培养板的检测。 7.2.2待测血清 待测血清在56℃下灭活30min。灭活时，将血清样本放在56℃恒温水浴箱内，水面要高于血清 液面，但不要超过试管高度。 7.2.3检测用培养板 以96孔细胞培养板进行检测。每个检测批次除了需要待测血清样品测定板（见C.3)若干以外，还 需设血清对照板（见C.1)和病毒对照板（见C.2）各1块。 7.3 检测操作 7.3.1血清的稀释 7.3.1.1 在培养板上分别标记清楚样品对应编号，每个样品的同一个稀释度设4个重复，稀释直接在