ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34750—2017 副猪嗜血杆菌检测方法 Detection methods for haemophilus parasuis 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T34750—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所、河北农业大 学动物科技学院、山东省农业科学院畜牧兽医研究所 本标准起草人：吴志明、闫若潜、张健、赵明军、赵雪丽、宋勤叶、徐引弟、王东方、王淑娟、安春霞、 刘梅芬、张盼盼、谢彩华、高凤山、方先珍、吴家强、拜廷阳、王一、刘淑敏。 GB/T 34750—2017 副猪嗜血杆菌检测方法 1范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌的分离与鉴定、巢式PCR检测和实时荧光PCR检测方法， 本标准适用于对猪的肺脏、心脏、脑等组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节液，抗凝血，细菌培养物等 样品中副猪嗜血杆菌的检测。 2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对(BasePair) DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphates） MGB：小沟结合（MinorGrooveBinder） NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide） PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution) PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） Taq 酶:Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase) TE:Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTABuffer) TSA：胰蛋白陈大豆琼脂（TrypticSoyAgar） TSB：胰蛋白陈大豆肉汤（TrypticSoyBroth） 3仪器 3.1 生物安全柜。 3.2 恒温培养箱。 3.3 光学显微镜。 3.4 全自动微生物鉴定仪。 3.5 PCR扩增仪。 3.6 高速冷冻离心机（12000×g以上）。 3.7 核酸电泳仪和水平电泳槽。 3.8 恒温水浴锅。 3.9 单道微量移液器（0.5μL~10μL;2μL~20μL;20μL~200μL;100μL~1000μL)。 3.10 组织匀浆器或研钵。 3.11 凝胶成像系统（或紫外投射仪）。 3.12 实时荧光定量PCR仪， 4耗材 4.11.5mL无菌离心管。 1 GB/T34750—2017 4.2 20.2mLPCR薄壁管或八联管。 5试剂 5.1TSA培养基和TSB培养基（见附录A)。 5.2NAD贮存液（见附录A），2℃～8℃条件下保存。 5.3革兰氏染色试剂：含草酸铵结晶紫染液、卢戈氏（Lugol)碘液、95%乙醇和沙黄（蕃红）染液，常温条 件下保存。 5.4葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖等微量生化鉴定管，2℃～8℃条件下保存。 5.53%过氧化氢、0.8%磺胺酸冰醋酸溶液、0.5%α-萘胺乙醇溶液、0.1%盐酸二甲基对苯二胺（见附录 A），常温条件下保存。 5.6消化液I和TE缓冲液（见附录B），常温条件下保存。 5.71×TAE核酸电泳缓冲液、酚-氯仿-异戊醇混合液（25+24+1)、0.01mol/L(pH7.2)的PBS、阿氏 液等试剂（见附录B），6×电泳上样缓冲液，75%乙醇，以上试剂2℃～8℃条件下保存。 5.8组织悬液、消化液IⅡ（见附录B），异丙醇，DNA标准分子量，置一20℃保存。 5.9阳性对照、阴性对照（见附录B)。 5.10巢式PCR扩增用上、下游引物序列（见附录C)。 5.11 副猪嗜血杆菌巢式PCR检测反应体系（见附录D） 5.12 副猪嗜血杆菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列（见附录C）。 5.13副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测反应体系（参见附录E)。 SAG 6细菌分离与鉴定 6.1样品的采集 无菌采集疑似副猪嗜血杆菌感染病死猪的肺脏、心脏、脑等新鲜组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节 液，抗凝血等样品。采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h。采集的样品密封后，采 用保温壶或保温桶加冰密封，运送到实验室。 6.2分离培养 使之形成菌落，以供鉴定用。 6.2.2取6.2.1中培养的针尖大小（直径约1mm～2mm）、圆形、隆起、光滑湿润、无色透明、边缘整齐 的小菌落，在TSA固体培养基上进行划线接种纯培养，37℃培养24h～48h后，出现上述小菌落 6.3涂片染色镜检 6.3.1涂片在载玻片上滴加1～2滴灭菌蒸馏水后，挑取纯培养的小菌落与灭菌蒸馏水混匀并涂成薄 菌膜。 6.3.2干燥将涂片于空气中自然晾干。 6.3.3固定将已干燥的载玻片涂面朝上，在酒精灯火焰上通过5次～6次进行固定。 6.3.4染色采用革兰氏染色法进行染色，具体操作按照革兰氏染色试剂盒说明书进行，置1000倍 （10×100）光学显微镜下观察。 6.3.5镜检副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性短杆状或球杆状小杆菌，菌体大小不等，约0.5um× （1.5um2.0um），以纤细杆状居多无鞭毛，不形成芽抱 2