ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34757—2017 猪流行性腹泻 病毒RT-PCR检测方法 Porcine epidemic diarrheaRT-PCR for detecting virus acid 2018-05-01实施 2017-11-01 发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34757—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：东北农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、河南牧业经济学院、河南农业 大学。 本标准主要起草人：李一经、邵卫星、魏荣、宋建德、姜艳平、袁丽萍、唐丽杰、乔薪瑷、崔文、徐耀辉、 吴发兴、张志、孙映雪、魏战勇、李晓成。 1 GB/T 34757—2017 猪流行性腹泻 病毒RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的仪器、试剂、样品的采集和处理、RT-PCR程 序、电泳及结果判定的技术要求 本标准适用于快速检测猪临床样品（猪小肠和新鲜粪便）或细胞培养物中猪流行性腹泻病毒核酸 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AMV.鸟类RNA病毒反转录酶（avianmyeloblastosisvirus) bp：碱基对（basepair) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：4种脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxyribonucleosidetriphosphates） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer） RNA：核糖核酸(ribonucleic acid) RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptase-polymerasechainreaction) RRI:RNA酶抑制剂(rnaseribonucleaseinhibitor） Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) 4仪器 4.11 PCR扩增仪。 4.2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 组织研磨器或者研钵。 4.4 冰箱2℃～8℃冰箱和-70℃以下超低温冰箱。 4.5 核酸电泳仪和水平电泳槽。 4.6 5微量移液器量程分别0.2L～2μL、1μL~10uL、10μL～100μL、20μL～200u和100μL~ 1000μL的移液器，并配备与移液器相匹配的吸头。 4.7 高压灭菌锅。 4.8 3凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 1 GB/T34757—2017 5耗材 5.11.5mL无RNA酶离心管。 5.2 20.2mLPCR管。 6试剂 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯。提取病毒RNA所用试剂应使用无RNA酶的容 器进行分装。 6.1水，GB/T6682，三级水。 6.2 2病毒裂解液：商品化RNA提取试剂盒，4℃~8℃保存。 6.3 氯仿：常温保存。 6.4异丙醇：使用前预冷至一20℃ 6.5 5无水乙醇：一20℃预冷 6.6 75%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，一20℃预冷。 6.7 AMV逆转录酶及5倍逆转录酶反应缓冲液：一20℃保存，避免反复冻融。 6.8 DEPC水：购买商品化DEPC水。 6.9 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：一20℃保存，避免反复冻融， 6.10 RRI：一20℃保存，避免反复冻融。 6.11 dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存.避免反复冻融 6.12 DNA分子量标准：DL2000bpDNAladder。 6.13 磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见A.1。 6.14 电泳缓冲液（TAE)：配方及配制方法见A.2。 6.15 样品处理液：配方及配制见A.3。 6.16 1%琼脂糖凝胶板：配制见A.4。 6.17 引物：见附录B。 6.18 猪流行性腹泻病毒阳性样品及阴性样品：阳性样品的制备参见C.1，阴性样品的制备参见C.2 阳性样品和阴性样品可由标准编制单位或国家指定实验室提供。 7 样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。 7.1.2注射器。 7.1.3 一次性无菌采样拭子。 7.1.4组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h。 7.2 样品采集 宜采集腹泻急性期的小肠（5.0cm~10.0cm）或新鲜粪便（5.0g~10.0g），放到密封袋中。 7.3 样品运输 2