ICS 65.020 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2288—2021 代替NY/T2288—2012 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫 检测与鉴定方法 Detection and Identification method of Cucumber green mottle mosaic virus 行业标准信息服务平台 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 2288—2021 言 全国农业前食品标准 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 起草。 本文件代替NY/T2288—2012《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法》，与NY/T2288—2012 相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下： a）逆转录聚合酶链式反应检测法反应体系运用的引物修改为更为灵敏的CGMMV-654F/CGM- MV-654R引物序列（上游引物PrimerF：5'-CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3；下游 引物PrimerR：5-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3')； b) 修订了结果判定逻辑顺序，调整为典型症状初步判断，快速检测高度疑似，酶联免疫吸附测定法 和逆转录聚合酶链式反应检测法最终判定； c）增加了档案保存章节及要求； d）修订了样品取样量的规定，区分了果实和叶片的取样量。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种植业管理司提出。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）归口。 本文件起草单位：全国农业技术推广服务中心、沈阳农业大学、辽宁省绿色农业发展中心、四川省农业 农村厅植物检疫站、四川农业大学。 本文件主要起草人：王福祥、王晓亮、吴元华、夏子豪、毕馨月、蔡明、江冬、郭迪金、李小松、何珊、尚静。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为： 2012年首次发布为NY/T2288—2012； 本次为第一次修订。 行业标准信息服务平台 NY/T 2288—2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法 1范围 本文件规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒的取样方法、检疫检测、结果判定和报告、样品处理和档案保存。 本文件适用于农业植物检疫中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疫检测与鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过 中的规范 用而构成本文件 小可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用 干 本（包活所有的修改单）适用于本 文件。 GB15569 农业 1 GB/T28071 3术语和定义 本文件没 4原理 黄瓜绿琪 Dirus CeMMV 与毒属，随种子、 接穗、砧木等 重要依据基典型症状及共他 内位疫检测与金 病毒双抗体夹 心酶联免疫吸 酶链式 合型定 MORTPU 5试剂与材料 水磷酸 碳酸钠(N 氢钾（KH2PO） 氯化钠（NaCI) aOH)、叠氮化钠 (NaN）,乙醇(C O EPY) 离子水、市售抗体、 PP 市售酶标抗体、市 见附 所有试剂均为分 福 6 仪器及用具 PCR仪、台式高速冷冻离 分光光度 、酶联板 读数仪、酶免洗板机、微量加样 器、水浴锅、电泳仪及水平电泳槽、凝胶成像系统、培养箱、冰箱 7取样 7.1种子 取样数量与方法按GB15569的规定进行，取样要充足，具有代表性。 7.2叶片及果实 随机选取发病或疑似发病叶片或果实，以幼嫩叶片和果实为主。每份果实样品不少于200g，叶片不 少于10g，装人自封袋中密封4℃保存，并注明植物名称、采集时间、地点、采集人等信息。 8检测 8. 1 症状检查 检查叶片、果梗、果实，与黄瓜绿斑驳花叶病毒病的典型症状进行比较（见附录B）。 1 NY/T2288—2021 8.2快速诊断 快速诊断试纸条或诊断试剂盒检测法见附录C。如采用市售的试纸条或试剂盒，按说明操作。 8.3酶联免疫吸附测定 黄瓜绿斑驳花叶病毒酶联免疫吸附测定法见附录D。如采用市售的试剂盒，按说明操作。 8.4逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR) 黄瓜绿斑驳花叶病毒逆转录聚合酶链式反应检测法（RT-PCR）见附录E。如采用市售的试剂盒，按 说明操作。 9结果判定和报告 9.1结果判定 9. 1. 1典型症状 果实发病且符合典型症状，可初步判定。 9.1.2快速诊断结果 快速诊断试纸条或诊断试剂盒检测结果为阳性的，可判定为高度疑似。 9.1.3酶联免疫吸附测定法 值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒。 9.1.4逆转录聚合酶链式反应检测（RT-PCR） 观察电泳结果，在阳性对照在654bp处有条带出现，且空白、阴性对照无条带出现的前提下，待测样 品在654bp处有条带出现，判定为阳性反应，即样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒。 9.1.5结果报告 将鉴定结果填入附录F的植物有害生物样本鉴定报告中。 10样品处理 检测过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理。经检疫鉴定后的种子样 11档案保存 采样信息、鉴定报告等原始资料妥善保存于植物检疫机构，保存期至少一年。 标准信息服务平台 2