ICS 65.100 NY CCS B 17 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3854—2021 看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 Technical code of practice for detection the target-site resistance of Alopecurus aequalis Sobol.to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibiting herbicides 行业标准信息服务平台 2021-11-01实施 2021-05-07发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3854—2021 全国煎业食晋标准 公共服务平台 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所 本文件主要起草人：崔海兰、李香菊、陈景超、李政、彭立存、郭小桐。 服务平台 NY/T3854—2021 看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂 靶标抗性检测技术规程 1范围 本文件规定了看麦娘（AlopecurusaequalisSobol.）对乙酰辅酶A羧化酶（acetylcoenzymeAcar boxylase，ACCase)抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程的基本要求及注意事项。 本文件适用于看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂产生靶标抗性的有关检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T1667—2008农药登记管理术语 NY/T1859.7—2014农药抗性风险评估第7部分：抑制乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性风险评估 NY/T3287—2018日本看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 3术语和定义 4检测程序 4.1材料培养 选择无看麦娘种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%～30%的草炭土，混合均匀后装人直径不 小于10cm的培养钵；待测种群及敏感对照种子分别定量均匀撒播在土壤表面，覆土约1cm，采用盆钵底 部渗灌方式补充水分，土壤相对湿度保持在60%～70%；置于25℃：15℃（D：N），光周期12h：12h （L：D）条件下培养。待看麦娘长至2叶1心期，间苗，每盆保留长势一致的10株。 4.2生物测定 待植株长至3叶1心期，用待测除草剂（ACCase抑制剂类除草剂）进行茎叶喷雾处理，药剂处理至少 设置5个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株。施药21d后，调查每个处理的存活植株数、地 上部分鲜重或于重，按公式（1)计算杂草株防效、鲜重或干重抑制率。 M. X100.. :(1) Ms 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%） 除草剂有效剂量Xga.i./hm处理后存活植株数、地L部分鲜重或干重的数值，单位为株或 克（g); M。 对照总株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或克（g）。 以杂草株防效、鲜重或干重抑制率为指标，按公式（2)计算生长抑制中量。 D-C (2) 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）； c Y值下限，单位为百分号（%）； D Y值上限，单位为百分号（%）； NY/T3854—2021 X 除草剂有效剂量的数值，单位为克每公项（ga.i./hm）； GR50 生长抑制中量的数值，单位为克每公项（ga.i./hm?）； 斜率。 按公式（3)计算抗药性倍数RI。 GRsOR RI : GRs0s :(3) 式中： RI 抗药性倍数； GR50R 抗药性种群生长抑制中量的数值，单位为克每公顷（ga.i./hm）； GRsos 敏感性种群生长抑制中量的数值，单位为克每公颅（ga.i./hm）。 4.3靶标基因检测 4.3.1DNA提取 PUBL 取杂草幼嫩叶片 mg.用 1.200 每个抗药性种群随机检测抗药性植株不少 用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的INA质五是否各 条清晰明亮的条带，表明DNA 较完整，无降解 DNA样品的级 检测：用分光光度 计测定DNA容液在 电度及浓厂 的吸光值（OD260）。OD260 ESEARCH 等于1时，样 DU浓 计免DNA浓度 (4) 式中： CNA DNA 度的数值单位为微 OD260 DNA A 稀释倍类 通过测定 DNA浴 H（OD 测D A纯度，OD260/OD280 oonn onn 处的吸光 在 1.7~2. 间表 经过电 和吸光度检测，质量和纯度符合要求的D 检测 4.3.2聚合酶链式反应（PCR） 用下列引 物 CCCAGCGGCAGA- cas CAGAT-3',反向 物贝 GTCTTG 为1437bp。也可参照 GenBank登记的看 列OenBank的登记 KX 设计引物扩增靶标基因 序列。 PCR反应体系如下 uffer2.5uL,10umol/L的引物 各0.5μL，5U/μL的Tag DNA聚合酶0. 的待测DNA 样品1，加人18无菌蒸馏水至 反应体系为25μL。PCR反应条件如下 .95℃加热5mim NA裂解变性；进入反应循环，在每一个循 5min，使产物延伸完整。上述引物的退火温度为56℃。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，与DNA分子量标准品比对，判断产物片段大小与预期是 否相符，根据条带亮度和有无杂带，判断产物浓度和扩增特异性。 4.3.3PCR产物测序 PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化 后的PCR产物测序，测序引物采用扩增日的片段的引物。 5结果分析 5.1剂量反应曲线结果分析 2