ICS65.020.01 CCSB 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3855—2021 小麦孢囊线虫检测技术规程 Technical code of practice for detection of wheat cyst nematodes 行业标准信息服务平台 2021-11-01实施 2021-05-07发布 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3855—2021 全国前业食标准 公共服务平台 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所。 本文件起草人：彭德良、彭焕、黄文坤、孔令安。 行业标准信息服务平台 NY/T3855—2021 小麦孢囊线虫检测技术规程 1范围 本文件规定了小麦孢囊线虫检测的术语和定义、试剂和设备、样本采集和分离、分子检测方法、结果判 定、样品保存。 本文件适用于小麦禾谷孢囊线虫（Heteroder ae）和菲利普孢囊线虫（Heteroderafilipjevi）的 分子检测。 2 规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 Q 文件。 GB/T6682 实验室用水 规格 试验方法 RESE NY/T3533 孢健线 重鉴定和监测技术规程 小 SN/T2757 植值 SEARCH 3术语和定义 NY/T3533 4试剂和设备 4.1主要试齐 4.1.1通用要求 实验用试剂均为分 用水应 6682中一级水的 规定。 4. 1.2蛋白酶K 容 液 4.1.310XPCR 4.1.4 Taq DNA 4.1.5dNTPs:dATP HmoLA 4. 1.6 琼脂糖凝胶：1.5 4. 1.7 1XTAE缓冲液 4.1.8核酸染料。 4.2主要设备 服务平台 4.2.1标准网筛：孔径分别为0.025mm.0.18mm和0.85mm 4. 2. 2 生物显微镜：40倍~1000倍。 4.2.3体视显微镜：10倍~120倍。 4.2.4可调量程移液器：2.5μL、10μL、100μL、200μL和1000μL。 4.2.5 凝胶成像系统。 4.2.6电泳仪。 4.2.7水平电泳槽。 4.2.8高速台式离心机。 4.2.9 PCR仪。 1 NY/T3855—2021 5样本采集和分离 5.1样本采集 按NY/T3533的规定执行。 5.2线虫分离 分离样品中的二龄幼虫和孢囊。分离方法参见NY/T3533—2020中附录B。 6分子检测 6.1线虫DNA提取 按附录A的规定执行。 6.2检测方法 6.2.1方法 采用常规PCR技术。 6.2.2引物 HaR1为 5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3'。 菲利普孢囊线虫的正向引物HfF1为5'CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3'，反向引物HIR1 为5'-AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3'。 引物溶液浓度均为10μmol/L。 6.3反应体系 在设定的PCR管中加人10×PCR缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL,正向引物和反向引物 各0.5μL，dNTPs2uL.待测样品的DNA模板1μL，用ddHO补至25μL。阴性对照用ddHzO代替 DNA模板。 6.4反应程序 95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。 程序结束后，PCR产物置于4℃保存。 6.5琼脂糖凝胶电泳检测 取10μLPCR产物在琼脂糖凝胶上电泳分离，经核酸染料染色后，在凝胶成像系统下观察。 7结果判定 阴性对照未出现条带，待测样品出现646bp条带判定检出菲利普孢囊线虫，待测样品出现1010bp 信息服务平台 条带判定检出禾谷孢囊线虫。结果判读见附录B。待测样品首次检测结果为阴性的，重复检测一次，两次 检测均为阴性时，待测样品判定为阴性。 8样本保存 田间采集的剩余样本应放置于4℃保存至少6个月，以备复检。 2