ICS 65.020.30 CCS B 43 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3875—2021 驴骤马源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of donkey,mule/hinny and horse derived materials- Real-time qualitativePCRmethod 行业标准信息服务平台 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3875—2021 全厨农业食品标准 起草。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本文件起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。 本文件主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、谭晴晴、杨雪、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、杨 连群、王俊燕、步迅。 行业标准信息服务平台 NY/T3875—2021 驴骤马源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 1范围 本文件规定了驴、骤和马3种动物源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。 本文件适用于动物肉、皮、毛中驴、骤和马3种动物源性成分的定性检测。 本方法定性检出限为1%。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件！ 文件。 GB/T6682 实验室质量空制规范 GB/T 27403 3术语和定义 下列术语和定 3. 1 L 实时荧光PCR realtimne PCR 在聚合酶链式反应OPC 积果实时格 PCR进程，对未 知模板进行定性或定量分机 3. 2 T Icyclethreshold, 循环数阈值 3. 3 肌肉肌酸激酶基因 kinase of muselegene,ckn rea ne 核 4原理 设计马属通妞物， 处分别设计马 根据驴和马的核基因ckm 马的特异性TagMan探 针，采用实时荧光PCR技术进行扩增，根据R扩增反的英光信号及循 國值，判定试样中含有驴、骤 和马3种动物源性成分的情况。 5试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1水：GB/T6682.级水。 5.2Tris-HCI缓冲液（1mol/L.pH6.4)：称取12.10gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用盐 5.3Tris-HCI缓冲液（0.5mol/LpH8.0）：称取6.05gTris置于100mL烧杯中，加人80mL水，用盐 5.4EDTA缓冲液（0.5mol/LpH8.0)：称取18.61gNa2EDTA·2HO置于100mL烧杯中，加人 80mL水，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100ml，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌 1 NY/T3875—2021 20min，室温保存待用。 5.5十二烷基磺酸钠溶液（SDS，10%）：称取10.00gSDS溶解于80mL水中，加水定容至100mL， 103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.6氯化钠溶液（NaCl.5mol/L）：称取29.22gNaCI溶解于80mL水中，加水定容至100mL，103.4 kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。 5.7细胞裂解液1：取Tris-HCI(0.5mol/L,pH8.0)缓冲液20mL、EDTA(0.5mol/L,pH8.0)缓冲 液5mL、NaCl溶液（5.0mol/L)10mL、10%SDS溶液5mL，加水定容至100mL。 5.8细胞裂解液Il：取Tris-HCI(0.5mol/L,pH8.0)缓冲液40mL、EDTA(0.5mol/L,pH8.0)缓冲液 5mL、NaCI溶液（5.0mol/L)10ml、10%SDS溶液5mlL，加水定容至100mL。 5.9蛋白酶K溶液（20mg/ml）：称取0.20g蛋白酶冻干品，加水溶解，加水定容至10mL，分装后于 一20℃保存。 室温，加水定容至10mL，分装成小份存于一20℃。 5.11二硫苏糖醇（DTT,1mol/L)：称取1.54gDTT，加人6mL水溶解，加水定容至10mL,分装后于 -20℃保存。 5.12硅珠悬浮液：称取5.00g的硅珠加入20mL水中充分混合，静置24h，弃掉上清液，然后加人 20mL水中充分混合，再静置5h，弃掉上清液。在沉淀的硅珠中加人5mL水，用盐酸调节pH至2.0。 5.13Chelex-100树脂（5%）：称取5.00gChelex-100树脂，溶解于水中，加水定容至100mL。 5.14DNA结合液：称取60.00g异硫氰酸胍（GUSCN），依次加入Tris-HCI缓冲液（1mol/L，pH6.4) 5mL、EDTA缓冲液（0.5mol/LpH8.0)8mL、TritonX-100溶液（60℃)4mL，加水定容至100mL。 5.15漂洗液：称取60.00g异硫氰酸胍（GUSCN），加人Tris-HCI缓冲液（1mol/L,pH6.4)5mL,再加 入EDTA缓冲液（0.5mol/LpH8.0)8mL,加水定容至100mL。 5.1670%乙醇：量取70mL无水乙醇，加人30mL水。 5.17TE缓冲液：依次加人Tris-HCI缓冲液（0.5mol/L.pH8.0)1mL、EDTA缓冲液（0.5mol/L,pH 8.0)0.1mL，加水定容至50mL，103.4kPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，降至室温，4℃保存备用。 5.180.5%洗毛剂：取100mL5%的商品化洗毛剂原液，加水900mL。 5.19实时荧光PCR检测试剂盒试剂：2XTaqManMasterMix，含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/ 20μL），Mg+（终浓度2.0mmol/μL），dNTPs（终浓度0.2mmol/uL），驴、和马3种动物源性DNA阳 性标准品。 5.20检测用引物和探针：外源质控引物探针序列和驴、骤和马3种动物的通用引物和特异性探针序列见 表1,引物探针在序列中的位置见附录A。 表1实时荧光定性PCR引物和探针序列 扩增片段 引物探针名称 缩写 序列（53） bp 外源质控引物上游 EC-F 5-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3 140 外源质控引物-下游 EC-R 5'CGAGATTGAGATCTTCTGCGAC3 外源质控探针 EC-P 5'-CY5-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCDAB3 通用引物-上游 ckm-F 5'-TCATCGTAGCATCGAGGGG-3 217 通用引物-下游 ckm-R5'-AGCAGAGCAGGAAGGGAGTT-3 5'-JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCT-BHQ23 驴源性探针 Lv-P 马源性探针 M-P 5-FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-DAB3 5.21 外源质粒：利用水将人工合成的外源质粒稀释至2×10-4ng/uL，外源质粒序列见附录A。 6仪器与设备 6.1实时荧光PCR仪：4通道以上（应能检测FAM、JOE和CY5荧光）。 2