ICS65.020.01 CCS B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3933—2021 水稻品种釉梗鉴定技术规程 SNP分子标记法 Technical code of practice for xian-geng identification in rice(Oryza sativa L.)SNP marker method 业标准信息服务平台 2022-05-01实施 2021-11-09发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3933—2021 厂食典通 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种业管理司提出。 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口。 本文件起草单位：中国水稻研究所。 本文件主要起草人：魏兴华、杨窑龙、徐群、章孟臣、王珊、冯跃、袁筱萍、余汉勇、王一平。 行业标准信息服务平台 NY/T 3933—2021 水稻品种釉梗鉴定技术规程 SNP分子标记法 1范围 本文件规定了利用SNP分子标记法对水稻（Oryza sativaL.）品种梗鉴定的术语和定义、缩略语、 原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备、操作步骤、数据记录与统计及判定方法。 本文件适用于水稻品种的釉梗鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成B件必不可少的条款 其中，注日期的引用文件， 文件。 GB/T3543.2 物种子 GB4404.1 粮食作 ：禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格机 S 术语和定义 3. 下列术语和定 3. 1 R sativa 釉稻Oryza 钟之 分布于低纬度低海拔的热 业热带的湿热地 通常 具有分巢性较强、 水稻的两个亚 文 生殖障 颖壳毛稀而短 1穗节 CE 3. 2 海技地 水稻的两个亚种 度的温带以及热带亚热带的高 通常具有分华性 、耐寒性较强的特点与釉业 种间存 较弱、颖壳毛密面 节间 定的生殖障碍。 3. 3 单核苷酸多态性 singleucleotrdepolymorphism,SNp 基因组序列之间单个核背酸变异弓的NA序列多态性 3. 4 参照基因组referencegenome 序列分析过程中，以一个已知的样本，序列信息较为清禁的基因组序列为模板对照，该基因组即为参 照基因组，本文件中参照基因组是梗稻品种日 列（版本号：IRGSP1.0）。 3. 5 釉型等位变异xian-specificallele 在釉稻品种中分布概率极高并在梗稻品种中分布概率极低的等位变异。 3. 6 梗型等位变异geng-specificallele 在梗稻品种中分布概率极高并在稻品种中分布概率极低的等位变异。 3. 7 釉型指数 xian index 釉型等位变异个数与所有等位变异个数的比值。 NY/T3933—2021 3.8 型指数gengindex 梗型等位变异个数与所有等位变异个数的比值。 3. 9 釉梗特异位点xian-geng specificlocus 针对品种釉鉴定而提供的，能够将稻品种与梗稻品种区分开的位点。 3. 10 参照品种reference sample 代表釉梗特异位点主要等位变异的一组样品。用于辅助确定待测样品在某个位点上的等位变异类 型，校正仪器设备的系统误差。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SNP：单核酸多态性（singlenucleotidepolymorphism） KASP：竞争性等位基因特异性PCR（competitiveallelespecilicPCR） FAM：羧基荧光素（carboxylluorescein） HEX：六氯荧光素（hexachlorofluorescein） 5原理 由于水稻釉稻与梗稻亚种间遗传组成不同，基因组DNA序列存在大量特异单个核昔酸的差异。这 种差异可以通过从供检样品中抽取有代表性的试样进行DNA提取，用釉特异性SNP位点引物进行扩 增和分型，从而利用单核甘酸碱基不同而加以区分品种釉梗特性。 6试剂和材料 以下所用试剂，除特殊注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。 6.1氯仿(CHCls，CAS号：6766.3)。 6.2异戊醇（C.H/2OCAS号：123-51.3)。 6.3异丙醇（CHO,CAS号：67-63-0)。 6.4无水乙醇(CH;CH,OH,CAS号：64-175)。 6.5十六烷基三甲基溴化铵[C16H3（CH）NBr.CAS号：57-090] 6.7三羟甲基氨基甲烷[NHCCH,OH)3.CAS号：77-86-1]。 6.8氯化钠（NaCl,CAS号：7647-14-5)。 6.9氢氧化钠（NaOH,CAS号：1310-73-2）。 6.102XPCRMIX。 6.1170%乙醇：量取350mL无水乙醇（6.4），用水定容至500mL，摇匀，备用。 6.12氢氧化钠溶液（1mol/L)：称取4g氢氧化钠（6.9)溶于水中，用水定容至100mL。 6.13氯仿/异戊醇混合液：氯仿（6.1）和异戊醇（6.2)按体积比24十1混合配置而成。 6.14DNA提取液：分别称取20g十六烷基三甲基溴化铵（6.5）、7.45g乙二胺四乙酸二钠（6.6）、6.05g三 羟甲基氨基甲烷（6.7）、81.9g氯化钠（6.8）溶解于约900mL水中，用氢氧化钠溶液（6.12）调节pH至 2