ICS11.220 CCSB 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 4031—2021 动物源性食品中住肉孢子虫检测方法 Detection methods of Sarcocystis spp.in animal-derived foods 行业标准信息服务平台 2021-12-15发布 2022-06-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T4031—2021 全国农业食品标 言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所、云南大学生命科学学院。 本文件主要起草人：陈兆国、米荣升、黄燕、龚海燕、张烨华、胡俊杰。 行业标准信息服务平台 I NY/T 4031—2021 动物源性食品中住肉孢子虫检测方法 1范围 本文件规定了动物肌肉中住肉孢子虫包囊检查和PCR检测方法的技术要求。 的隆美尔住肉孢子虫（S.rommeli），水生 牛中寄生的德宏住肉孢子虫（S.dehongenhsis），耗牛中寄生的枯 氏住肉孢子虫（S.cruzi）、莱氏住肉孢子虫（S. mei.S.hirsutu fusiformis、人住肉孢子虫（S. bouini），山羊中寄生的山羊 Lhraris 犬住肉孢子虫（S.capra canis 寄生的柔嫩住肉孢子虫（S. tenella）、白羊犬住肉孢子虫 ertrami），猪中寄生的米 氏住肉孢子虫（S. RE 2规范性引用文 牛 下列文件中的内 为容通过 中的规范型 日期的引用文件， 仅该日期对应的版 文佳妞的可用校 单）适用本文件。 修改 GB/T 6682 分析卖 室用水现格和试验方 2002 WS/T 230 R 3术语和定义 本文件没有 CEN 4缩略语 用甲本 下列缩略语适 coxl：线粒体 nt1)基因 DNA：脱氧核 ynip! EB：溴化乙锭 PCR：聚合酶链式 (Poly) PBS：磷酸盐缓冲液Pho sphate TAE：Tris-乙酸电泳缓冰 5样品的采集、保存和运输 5.1样品的采集 根据不同动物肌肉的具体情况，每头动物采集体一个部位或多个部位肌肉，尤其注意采集这些肌肉 中有米粒状包囊的肌肉样品，记为一份肉样，其质量不少于50g。 5.2样品的保存和运输 5.2.1采集的样品，不超过24h检测的，在2℃～8℃条件下保存即可；1月以内检测的，存放温度不高 于一20℃；超过1个月检测的，存放于一80℃以下冰柜，或浸泡在福尔马林溶液中。所有阳性样品，发出 检测报告30d后方可无害化处理。 5.2.2样品应放在不透水、防泄漏的密封袋中，置于保温盒中，并加冰袋或冰块保持低温，尽快送到实验 室。所有样品应附有一份说明，内容包括样品提交人、样品采集地点（最好标明经度和纬度）、采样日期、联 系方式、动物种类、动物年龄（日龄）、动物部位、动物病史等。 1 NY/T 4031—2021 6检测方法 6.1压片镜检法 6.1.1主要仪器设备 6.1. 1.1外科手术剪。 6.1.1.2不锈钢镊子 6.1.1.3不锈钢、铝合金或塑料肉样盘，内有格子并编号。 6.1.1.4载玻片。 6.1.1.5普通生物显微镜或倒置显微镜。 6.1.2试剂 6.1.2.1甘油（生化级）：市售产品。 6.1.2.2甘油透明液（见附录A中的A.1)。 6.1.3操作方法 6.1.3.1目检 察肌肉内、肌肉表面是否含有纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状，与肌纤维方向平行的灰白色或 乳白色包囊。 6.1.3.2压片镜检 取目检时剪取的包囊、疑似包囊，直接用2片载玻片压片镜检。目检未见包囊的肉样，按随机采样的 要求，用剪刀顺肌纤维方向剪取肉样，再沿肌纤维方向剪成铅笔芯大小的小条（约10mm×3mm× 3mm），每个部位至少4条。将剪取的肌肉放在载玻片上，每片放置4条～6条。必要时，可添加适量甘 油透明液。另取一块载玻片重叠放在有肉条的载玻片上，用力挤压，使肉条压成半透明（能初步看清另 块载玻片下面背景的字样）。把制好的压片放在低倍显微镜下（10倍×10倍），从压片一端的边沿开始检 查，直到另一端为止。 6.1.4结果判定 6.1.4.1不同种类的住肉孢子虫包囊大小、形态差异很大，部分种类肉眼可辨，如山羊的莫尔氏住肉孢子 虫（Sarcocystismoulei）和绵羊的巨住肉孢子虫（S.gigantea）的包囊。莫尔氏住肉孢子虫包囊呈暗白 色、卵圆形，长可达17mm，宽可达7mm，常见于食道；包囊内壁分枝，呈菜花状，包含13μm~15μm长 的缓殖子；有时可见2种大小的包囊：一种末端粗而圆，缓殖子大小为（1117)μm（平均14.1μm）×（3～ 6)μm（平均4.5μm），仅在食道肌肉中出现，另一种为薄壁包囊，小而细，所含缓殖子大小为（9～13）μm （平均12.2μm）×（2~4）μm（平均2.9μm），可见于腩肌和骨骼肌中。肉眼可见的巨住肉孢子虫包囊主 要存在于年龄较大的老羊，食道、喉和舌头常见，横隔膜和体的其他部位较少出现，其包囊长度可达 1cm，呈暗白色，圆形、椭圆形或梨形，有时类似米粒。包囊壁薄（<2um）、光滑，常被结缔组织包围。但 多数家畜、家禽寄生的住肉孢子虫种类的包囊肉眼难以觉察，如猪的住肉孢子虫包囊长仅2mm或更小。 因此，目检法若直接在肌肉内发现住肉孢子虫大型包囊，可判为疑似，继续进行显微镜观察；未发现住肉孢 子虫大型包囊，按显微镜观察结果判定。 滑或表面有横纹、短指状突起，压迫包囊溢出有大量直径10μm～20μm，呈圆形、椭圆形或香蕉形、颜色 偏暗的缓殖子（如果虫体已经钙化，则呈黑色小团块）（见附录B），即可确定为住肉孢子虫感染。一份肌肉 样品任一部位发现有住肉孢子虫包囊，即可判定该份肉样为住肉孢子虫阳性；若各部位肌肉均未发现住肉 孢子虫包囊，则判定为阴性。 6.2PCR法 6.2.1仪器 2