ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T33526—2017 转基因植物产品数字PCR检测方法 Genetically modified organism detection method by digital PCR 2017-09-01实施 2017-02-28发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 33526—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 农业大学、中国农业科学院油菜作物研究所。 本标准主要起草人：付伟、杜智欣、王勤、王慧煜、许文涛、吴刚、朱水芳、刘晓飞 GB/T335262017 转基因植物产品数字PCR检测方法 1范围 本标准规定了转基因成分检测的数字PCR方法。 本标准适用于玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯、首、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数字 PCR检测。 本标准所能达到的检测低限为0.1%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 18srRNA基因 日18srRNAgene 转录自18srDNA，是细胞核糖体的组分之一。 3.2 CaMV35s启动子基因 1CaMV35spromotor 来自花椰菜花叶病毒（Cauliflowermosaicvirus，CaM）的35s启动子。 3.3 NOS终止子基因NOSterminiton 来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。 4原理 数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增 并后续检测。通过对反应体系进行有限的分割，从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子，并且 更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。 现阶段数字PCR的实现形式包括芯片式数字PCR与微滴式数字PCR两种。其中芯片式数字 PCR通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割，这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点，但是 这种分割方式的实验成本相对较高；微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分 1 GB/T33526—2017 割。这种分割方式具有反应速度快，分割成本低的优点，但是相对来说，这种分割方法的稳定性较差，而 且对于数据分析的要求也相对较高。由于数字PCR的平台差异，对不同数字PCR平台进行的数据协 同分析也成为了目前数字PCR检测方法发展的关键 本标准针对通用筛选元件CaMV35s启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行数字 PCR扩增，并根据扩增结果来判定CaMV35s启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分。另外，通过 芯片式数字PCR和微滴式数字PCR的协同比对，本标准方法可以在两种平台中达到同样的检测目的。 5试剂与材料 除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 5.1DNA提取试剂盒 推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒， 5.2数字PCR反应试剂盒 推荐按照不同的数字PCR平台的说明书选取其推荐的数字PCR反应试剂盒 5.318srRNA基因引物和探针 18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3 18s-R:5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 18s-P:5'-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3' 5.4CaMV35s启动子基因引物和探针 p35s-F:5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3' p35s-R:5'- CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3' 5.5NOS终止子基因引物和探针 TNOS-F:5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3 TNOS-R:5-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3 TNOS-P:5'-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1-3 6仪器与设备 6.1分析天平：感量0.1mg。 6.2生物安全柜 6.3数字PCR扩增仪。 6.4纯水仪。 6.5核酸定量仪。 6.6涡旋震荡仪。 6.7其他相关仪器和设备。 6.8离心管。 2