ICS 71.040.30 G 66 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 33412—2016 生物制品中羟基柠檬酸的测定 高效液相色谱法 Determination of hydroxycitric acid in biochemical products- HPLC method 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33412—2016 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：上海市计量测试技术研究院 本标准主要起草人：刘刚、李兰英、丁敏、闻艳丽、徐勤、许丽。 GB/T33412—2016 生物制品中羟基柠檬酸的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了用高效液相色谱法测定保健（功能）类生物制品中羟基柠檬酸含量的方法。 本标准适用于口服液、胶囊、颗粒冲剂等生物制品中羟基柠檬酸的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样中羟基柠檬酸用水提取，经离心后，上清液经0.45um微孔滤膜过滤，经高效液相色谱分离，紫 外检测器检测，外标法定量，测定羟基柠檬酸的含量。 4试剂和溶液 除另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醇：色谱纯。 4.2 磷酸。 4.3 体积分数0.1%磷酸水溶液：准确吸取1mL分析纯磷酸，用水稀释并定容至1000mL。 4.4 羟基柠檬酸标准品（CAS号：6205-14-7）：纯度≥98%。 4.5美 羟基柠檬酸标准储备液：准确称取1g（精确至0.001g）经过95℃土2℃干燥2h的羟基柠檬酸标 准品，加适量水溶解，转移至100mL容量瓶中，用水定容，摇匀。羟基柠檬酸标准储备液浓度 为10.000 mg/mL 4.6羟基柠檬酸标准溶液：使用前，将10.000mg/mL的羟基柠檬酸标准储备液用水逐级稀释，制成浓 度为1.000mg/mL.0.500mg/mL.0.200mg/mL.0.100mg/mL.0.010mg/mL,0.001mg/mL的羟基 柠檬酸标准溶液。 5仪器与设备 实验室常规设备及下列各项： 5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。 5.2分析天平：感量0.01g,0.001g。 5.37 高速离心机：10000g。 5.4滤膜：0.45um，水相。 1 GB/T33412—2016 5.5 超声波清洗器。 5.6研钵。 常用玻璃量器，A级。 6试样的制备 6.1[ 固体试样 从研磨成粉末（胶囊取胶囊内容物)的混匀试样中称量1.0g试料（精确至0.01g），置于烧杯中，加 水40mL，超声波清洗器100W超声20min，冷却至室温后转移至50mL容量瓶，并加水定容。 6.2液体试样 从试样中准确移取试料1.00mL，加水稀释并定容至10mL。 上述上清液即为试料溶液。 7 分析步骤 7.1 液相色谱参考条件 色谱柱：AtlantisT3Cis色谱柱(150mmX4.6mm，5μm)，或相当者； 流动相：0.1%磷酸水溶液十甲醇，体积比（99十1）； 流量：0.6mL/min； 柱温：室温； 检测波长：210nm； 进样量：10μL。 7.2 绘制标准曲线 分别吸取羟基柠檬酸系列标准溶液，用0.45μm滤膜过滤，注人高效液相色谱仪，进样10μL，进行 测定，以各标准溶液浓度峰面积为纵坐标，以标准溶液标准浓度值为横坐标，绘制标准曲线，并关联获得 标准曲线公式，标准曲线的相关系数应该不小于0.999。羟基柠檬酸标准品色谱图参见附录A中 图A.1。 7.3样品分析 吸取试料溶液（6.2），用0.45um滤膜过滤，注人高效液相色谱仪，在7.2相同条件下进行测定。根 据色谱峰面积，利用线性回归方程计算试料溶液中羟基柠檬酸的含量。典型样品色谱图参见图A.2。 8结果计算 8.11 固体试样 固体试样中羟基柠檬酸的含量（质量分数）按式（1）和式（2）计算： p-V .(1) :(2) m; 2