ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 33115—2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Narcissus late season yellows virus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 33115—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 和国宁波出人境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人：沈建国、李敏、蔡伟、李桂芬、张永江、虞赞、干文涛、郭立新、高芳銮、吴祖建， I GB/T33115—2016 水仙迟季黄化病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了水仙迟季黄化病毒（Narcissuslateseasonyellowsvirus）的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带水仙迟季黄化病毒的水仙及水仙产品检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964 植物病毒检测规范 SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3水仙迟季黄化病毒基本信息 中文名：水仙迟季黄化病毒。 学名：Narcissus late season yellows wirus，缩写NLSYV。 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyuiridae），马铃薯Y病毒属（Potyuirus）。 水仙迟季黄化病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 5仪器、用具及试剂 5.1仪器 高速冷冻离心机、电子天平、PCR仪、荧光PCR仪、水平电泳系统、一20℃低温冰箱和一80℃超低 温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标 仪等。 5.2用具 酶联板、可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100uL、200μL、1000μL）和可调移液器头、离心管、研 钵等。 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。PTA-ELISA检测 1 GB/T33115—2016 试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D。 6抽样和样品制备 6.1抽样 抽样方法按照SN/T2122中规定执行。 6.2样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行。 7检测鉴定 7.1PTA-ELISA检测 以含NLSYV材料作为阳性对照，以不含NLSYV的健康植物组织作阴性对照，同时以样品提取缓 冲液作为空白对照，具体操作见附录B。 7.2 2RT-PCR检测 以含NLSYV材料作为阳性对照，以不含NLSYV的健康植物组织作阴性对照，同时以ddHO代 替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作 见附录C。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 7.3实时荧光RT-PCR检测 以含NLSYV材料作为阳性对照，以不含NLSYV的健康植物组织作阴性对照，同时以ddH,O代 替模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测，具体操作见附录 D。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 8结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： PTA-ELISA初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带NLSYV；若检测结果为阳性， 则采用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行验证。 若验证结果为阳性，则判定样品携带NLSYV；若验证结果为阴性，则判定样品不携带 NLSYV. 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带NLSYV的样品应保存在适合的条件下以备复核。种苗、叶片等样品保存在 80℃冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少6个月。 9.2 结果记录 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。PTA-ELISA 检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片。 2