ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T33120—2016 梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Pear blister canker viroid 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33120—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出人境检验检疫 局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国 山东出入境检验检疫局、中华人民共和国检验检疫科学研究院、华中农业大学植物科技学院， 本标准主要起草人：王振华、陈定虎、叶芸、徐文兴、徐家文、曾宪东、徐雪、张永江、王、李曼、王英超、 吴兴海。 I GB/T33120—2016 梨疱状溃疡类病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了梨疱状溃疡类病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境梨树种苗、组培苗及植株中梨疱状溃疡类病毒的检疫和鉴定 梨疱状溃疡类病毒基本信息 2 学名：Pearblister canker viroid。 缩写：PBCVd。 异名：梨泡斑类病毒。 分类地位：马铃薯纺锤块茎类病毒科（Pospiviroidae），苹果锈皮类病毒属（Apscaviroid）。 传播途径：通过嫁接、芽接和刀具机械传播，但没有有关介体及种子传毒的报道。远距离通过种苗 调运传播 梨疱状溃疡类病毒的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据梨疱状溃疡类病毒全长RNA核酸链中的保守区域设计了一对扩增该类病毒全长核酸的弓 物，进行RT-PCR扩增和序列测定；根据梨疱状溃疡类病毒全长核酸序列设计与正单链RNA互补的单 链RNA探针，通过杂交信号强弱进行结果判定。 4仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 超净工作台、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、垂 直电泳槽、PCR仪、凝胶成像系统、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪等 4.2 2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。RT-PCR试剂见附录B；分子杂交试剂见附录C。 5症状观察 取样品量1%～5%（若样品少可适量增大比例）的种苗进行检查。检查梨疱状溃疡类病毒侵染症 状，树皮上形成疱状物或树皮开裂、溃疡、鳞状表皮或表皮深裂，树势衰退。 1 GB/T331202016 6 实验室鉴定 6.1RT-PCR检测 RT-PCR检测见附录B。 6.2 分子杂交检测 分子杂交检测见附录C。 结果判定 7 在每次检测中阴性对照和空白对照均表现为阴性，而阳性对照表现为阳性，则说明检测体系可靠， 在此条件下，如果样品经RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性反应，并经测序验证，则可判定样 状溃疡类病毒。 8 样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨疱状溃疡类病毒的样品应嫁接在砧木上，温室大 棚种植隔离保存，同时一70℃超低温保存，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 8.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法、RT-PCR检测结果图片、核 苷酸测定序列、分子杂交检测结果图片等，并要有实验人员和审核人员签字。 N